人胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型建立的研究進展

王霞 董孟佳

[摘要] 我國是消化道腫瘤的高發地區，早診斷、早治療是降低胃癌死亡率的重要手段。建立胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型是研究胃早期癌變的方法之一。目前常用的模型誘導劑有亞硝基胍、幽門螺桿菌、鵝去氧膽酸、赭曲霉毒素A、非編碼轉錄調控基因表達等，但尚缺乏成熟公認的標準。本文就近年來文獻發表的胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型作一綜述，介紹各類模型制備方法、胃黏膜上皮細胞的形態變化、分子表達差異及其致病原理，為后續實驗研究提供參考。

[關鍵詞] 惡性轉化;細胞模型;胃黏膜上皮細胞;癌前病變

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0036-04

[Abstract] China is a high incidence area of digestive tract tumors. Early diagnosis and early treatment are an important means to reduce the mortality of gastric cancer. The establishment of malignant transformation model of gastric mucosal epithelial cells is one of the important methods to study early gastric cancer. Currently model inducers include nitrosoguanidine， Helicobacter pylori， chenodeoxycholic acid， ochratoxin A， non-coding transcriptional regulatory gene expression and so on. There is no established standard for model development. This paper summarizes the malignant transformation model of gastric mucosa epithelial cells published in recent years， and introduces the methods of model preparation， related morphology， molecular expression difference and its pathogenic principle， so as to provide reference for further experimental research.

[Key words] Malignant transformation; Cell model; Gastric mucosal epithelial cells; Precancerous lesion

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，其發病率居世界惡性腫瘤的第四位，死亡率居惡性腫瘤的第三位[1-2]，嚴重威脅人類健康。目前被認可的胃癌發生進展模式是Correa等[3]提出正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎（CSG）-慢性萎縮性胃炎（CAG）-胃黏膜腸上皮化生（IM）-異型增生（中度/重度）-胃癌（腸型）。從CAG到胃癌發生前統稱為癌前病變（PLGC），此過程具有可控制、可逆轉性，是胃癌防治的重要階段。PLGC伴隨胃黏膜上皮細胞向胃癌細胞的惡性轉化，積極探索胃黏膜上皮細胞惡性轉化的發病機制和治療靶點，對于預防胃癌和降低胃癌發病率至關重要。細胞惡性轉化指外源性因素對體外培養的細胞誘發的惡性表型改變，包括細胞形態、細胞增殖速度、生長特征（如錨著獨立性生長或接觸抑制消失等）、染色體畸變等方面的改變;轉化的細胞接種在裸鼠皮下可形成肉眼可見的腫瘤。成瘤性是確定細胞發生惡性轉化的可靠指標[4]。

目前關于胃黏膜上皮細胞惡性轉化的研究并不多，其細胞模型的制作方法和標準也沒有完全統一。探索胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型的標準制作方法對推動胃癌發生的相關機制和藥物研究具有重要意義。常見的人胃黏膜上皮細胞（GES-1）具有正常人胃上皮細胞的特性和功能，可在體外穩定傳代，且不具有錨著獨立生長能力，接種裸鼠后6個月內不會成瘤。這些生物學特性使其成為了解正常胃黏膜上皮細胞離體特征及研究胃癌致病機制的良好選擇[5]。現將常見的誘導GES-1惡性轉化細胞模型的制作方法總結如下：

1 N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘導GES-1細胞惡性轉化模型

MNNG誘導GES-1細胞惡性轉化模型是研究最早且最多的實驗方法。流行病學資料顯示[6]，亞硝酰胺類化合物與人胃癌的發生密切相關，人體中亞硝基化合物主要通過亞硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物、酒精飲料及體內的細菌還原硝酸鹽而產生。MNNG是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學誘變劑和致癌劑，主要用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機制。研究顯示，MNNG能誘導大鼠胃癌前病變的發生，是研究天然植物預防胃癌的最常用的致癌劑[7]。

研究發現[8]，經過MNNG處理后的GES-1細胞即MC細胞，隨著傳代的繼續，細胞形態發生改變，從最初的梭形變成不規則形，細胞間接觸緊密，呈“島樣”克隆生長。MNNG作用于GES-1細胞24 h后，MC細胞失去接觸抑制能力，染色體畸變增多、細胞增殖率增加、獲得軟瓊脂集落生成能力。提示MNNG使GES-1細胞發生質變，轉化后的細胞具有腫瘤細胞的生物學特性[9]。張水蓮[10]應用低劑量MNNG和同類藥物N-甲基-N亞硝基脲（MNU）處理GES-1細胞，每周處理1次，連續處理4周后，細胞在正常培養基中繼續傳代，繼續培養8周，隨后進行細胞惡性表型檢測以及裸鼠體內成瘤實驗，結果顯示MNNG和MNU能成功建立胃黏膜上皮細胞惡性轉化模型。Yang等[11]在此基礎上，將惡性轉化成功的細胞多次稀釋后挑取單個細胞形成克隆并擴大培養，制成單克隆細胞株，用于后續研究。

MNNG是一種不依賴于酶的代謝能夠直接作用于胃腸道黏膜引起癌變的活性致癌劑，其可直接滲透胃幽門部和胃底部黏膜，誘發大鼠及犬實驗性胃癌的發生。目前MNNG致癌機制尚不明確，可能與其促使胃黏膜發生上皮-間質轉化、激活Wnt/β-catenin信號通路、促發胃黏膜上皮癌變的啟動因子相關[12-13]。

2 幽門螺桿菌（Hp）誘導GES-1惡性轉化

自從Marshall成功培養和分離出Hp以來，文獻報道證實，Hp感染與胃癌癌前病變的發生密切相關[14-15]。世界衛生組織（WHO）將Hp列為第一類致癌危險因素。

劉琳娜等[16]按細胞∶細菌1∶50、1∶100、1∶200的比例分別加入GES-1細胞和高、低表達硫氧還蛋白1的Hp菌株共培養，發現隨著Hp濃度增高、作用時間延長，GES-1細胞出現形態改變，細胞壁變得不光整，貼壁細胞數量減少，懸浮細胞增多，細胞的增殖活性逐漸受到抑制且呈觀察時間和Hp濃度依賴性，細胞周期中進入S期的比例升高。鄧志燕等[17]將濃度為1×109 CFU/mL的Hp菌液加入GES-1細胞中，按細菌∶細胞為200∶1共培養24 h，發現Hp感染后可顯著抑制GES-1細胞增殖，誘導細胞凋亡，誘導胃黏膜上皮炎癥細胞的浸潤，釋放白細胞介素（IL）-1β、IL-8等炎癥介質。

Hp致病性主要依賴鞭毛、螺旋結構、脂多糖、細胞毒素相關蛋白和空泡毒素等多種致病因子，其致病機制復雜，目前發現Hp感染GES-1細胞后，可影響細胞自噬、多胺代謝異常，干擾細胞增殖、凋亡，促使腫瘤的發生[18-19]。

3 鵝去氧膽酸（CDCA）刺激GES-1細胞建立腸上皮化生（IM）模型

膽汁酸刺激是胃黏膜IM發生的重要內源性因素，CDCA是膽鹽的原體，可模擬膽汁反流對胃黏膜的傷害刺激，用于胃黏膜上皮細胞IM模型的建立。李紅[20]選用4種含有特定濃度的膽汁酸刺激GES-1細胞，最終確定CDCA刺激24 h效果最佳，并用Western blot和免疫熒光分別檢測了腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的表達，證實其可作為胃黏膜IM的細胞模型。沈和德等[21]將CDCA溶解至無胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養液中，配成濃度為100 μmol/L的無血清培養基，加入到融合度80%的GES-1細胞中，24 h后換正常培養液繼續培養，與對照組比較，CDX2抗體在CDCA誘導的GES-1細胞呈陽性表達，提示CDCA能誘導胃黏膜IM。劉洪等[8]采用不同濃度CDCA、MNNG刺激GES-1細胞，發現兩者對GES-1細胞均有抑制作用，半數抑制濃度分別為0.42、173.79 μmol/L，鏡下觀察細胞形態均呈長梭形。提示MNNG、CDCA可通過下調胃特異性基因MUC1表達、上調腸特異性基因CDX2表達模擬胃黏膜腸化生細胞學改變，構建IM模型。

4 赭曲霉毒素A（OTA）誘導GES-1細胞惡性轉化

OTA是一種真菌毒素，由曲霉菌和青霉菌株產生，廣泛存在于糧食作物和咖啡、面包等食品中，流行病學調查發現[22]，河北部分地區出現胃癌高發與OTA廣泛污染密切相關。2.5 μmol/L OTA作用于GES-1細胞，40代后細胞形態發生明顯變化，細胞鏡下呈多角形，大小不一，細胞間排列緊密，可見多核巨細胞，且呈團塊狀生長，排列紊亂，很多細胞周邊多呈毛刺狀，細胞遷移能力增強，可成功建立裸鼠成瘤模型。其作用機制可能與氧化應激，Wnt/β-catenin通路活化、誘導細胞周期蛋白表達相關[23-24]。崔晉峰等[25]發現OTA可以增加GES-1細胞微核的形成，誘導GES-1細胞染色體發生畸變。

5 非編碼轉錄調控基因表達誘導GES-1細胞惡性轉化

各類RNA間存在相互作用的網絡，可以通過基因編輯技術，競爭性結合相應的miRNA，對該miRNA后續轉錄后調控作用發生有效控制，調控與癌癥相關基因和通路的表達，促使細胞惡性轉化。研究發現[26]，GES-1細胞經質粒轉染后，通過影響miR-200a/b/c表達，出現GES-1細胞的惡性轉化傾向，增加細胞的侵襲、遷移能力。

6 小結

N-亞硝基化合物、高糖類伴低蛋白食物、高鹽飲食、霉變食物、Hp感染、維生素C缺乏、吸煙、年齡、胃癌家族史等均是胃癌發生的高危因素，這些危險因素也為建立胃癌實驗模型的方法提供參考。

對于體外細胞惡性轉化的鑒定目前尚無金標準。綜合比較上述GES-1細胞惡性轉化模型的建立方法，MNNG和Hp感染誘導GES-1細胞實現惡性轉化的方法較為可靠，具有穩定性，可重復性。但Hp感染形成的模型細胞克隆形成率低于親代對照細胞，不利于藥物干預和研究，因此一般不將Hp作為唯一的致病因素來制作細胞惡性轉化模型，更多的把Hp感染用作藥物根除模型。CDCA誘導GES-1細胞實現惡性轉化，只構建IM模型，缺少對萎縮性胃炎模型的研究，并且模型的檢驗標準是通過鑒定KLF4、VILLIN及MUC2等相關特異性分子，細胞形態學的研究不夠詳細，是否具有成瘤性仍需進一步檢驗。OTA、非編碼轉錄調控基因表達誘導GES-1細胞惡性轉化具有參考價值，但相關報道較少。此外，腫瘤壞死因子α、乙醇等對GES-1的影響，著重于黏膜損傷，和細胞惡性轉化尚有一定距離。

綜上所述，MNNG誘導GES-1細胞惡性轉化，參考性強，是更容易成功的實驗方法。該細胞模型的制作為胃癌癌前病變和相關藥物的作用機制探索奠定了科學的基礎。

[參考文獻]

[1]? Bray F，Ferlay J，Soerjomataram I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2]? Cai Z，Liu Q. Understanding the global cancer statistics 2018：implications for cancer control [J]. Sci China Life Sci，2019.

[3]? Correa P，Piazuelo MB，Camargo MC. Etiopathogenesis of gastric cancer [J]. Scand J Surg，2006，95（4）：218-224.

[4]? 宋英利，席淑華.慢性砷染毒致細胞惡性轉化機制的研究進展[J].環境與健康雜志，2013，30（10）：940-942.

[5]? 柯楊，寧濤，王冰，等.人胃黏膜上皮細胞GES-1的建立及其生物學特性[J].中華腫瘤雜志，1994，16（1）：7-10.

[6]? 徐淼，張倩男，楊輝，等.亞硝胺及前體化合物的致癌效應及其食用安全性研究進展[J].癌變·畸變·突變，2018， 30（1）：76-79.

[7]? Wang X，Liu H，Wang X，et al. Preventive Effect of Actinidia Valvata Dunn Extract on N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-induced Gastrointestinal Cancer in Rats [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（15）：6363-6367.

[8]? 劉洪，王珅，蔣凱林，等.MNNG、CDCA構建胃黏膜上皮細胞GES-1腸化生模型的可行性[J].山東醫藥，2018， 58（24）：1-4.

[9]? Sun ZQ，Yan HM，Jia B，et al. Morphology and function of the malignant transformation of GES-1 of immortalized cell induced by MNNG [J]. Chin J Modern Med，2012，22（22）：14-18.

[10]? 張水蓮.組蛋白修飾參與化學致癌劑MNNG和MNU誘發人胃黏膜上皮細胞惡性轉化的機制研究[D].杭州：浙江大學，2016.

[11]? Yang Q，Xu E，Dai J，et al. miR-21 regulates N-methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidine-induced gastric tumorigenesis by targeting FASLG and BTG2 [J]. Toxicol Lett，2014， 228（3）：147-156.

[12]? 嚴展鵬，徐婷婷，安振濤，等.單功能烷化劑MNNG對人胃粘膜上皮GES-1細胞的損傷及其對Wnt/β-catenin信號通路的影響[J].生理學報，2018，70（3）：262-268.

[13]? 蔡潔，王梅.胃上皮細胞經亞硝基化合物MNNG短時刺激后細胞形態、功能特性的變化[J].山東醫藥，2018， 58（18）：26-29.

[14]? 懷千.幽門螺桿菌與胃癌致病機制及相關治療方案的研究進展[J].蚌埠醫學院學報，2019，44（6）：839-841.

[15]? 單輝國，華付，陳婷，等.胃癌和癌前病變黏膜組織環氧化酶-2、表皮生長因子受體表達與幽門螺桿菌感染的相關性[J].湖南師范大學學報：醫學版，2019，16（5）：67-70.

[16]? 劉琳娜，丁士剛，石巖巖，等.表達硫氧還蛋白1的幽門螺桿菌對人胃上皮細胞株GES-1生長的影響[J].胃腸病學，2015，20（2）：93-96.

[17]? 鄧志燕，萬強.黃芩苷對幽門螺桿菌誘導人胃黏膜上皮GES-1細胞損傷的保護作用及機制[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（19）：145-149.

[18]? 熊勵晶，童煜，謝曉麗，等.上調自噬對幽門螺桿菌感染后人胃上皮細胞GES-1的保護作用[J].中華消化病與影像雜志：電子版，2015，5（3）：35-38.

[19]? 李論，陳鵬飛，朱俊垚，等.幽門螺桿菌相關胃癌與多胺代謝[J].生命的化學，2018，38（6）：787-791.

[20]? 李紅.miR-92a在胃黏膜腸上皮化生中調控CDX2的作用與機制研究[D].西安：第四軍醫大學，2014.

[21]? 沈和德，褚明亮，易韋，等.膽汁酸誘導胃黏膜上皮細胞腸化生模型的建立與快速鑒定[J].甘肅醫藥，2017，36（6）：442-444.

[22]? 李增寧，楊惠霞，張祥宏，等.河北省食管癌、胃癌高發區居民食用小麥赭曲霉素A污染情況分析[J].衛生研究，2006，6（35）：754-755.

[23]? 賈欣.赭曲霉毒素A誘導人胃黏膜上皮細胞惡性轉化及可能機制的研究[D].石家莊：河北醫科大學，2014.

[24]? Jia X，Cui J，Meng X，et al. Malignant transformation of human gastric epithelium cells via reactive oxygen species production and Wnt/β-catenin pathway activation following 40-week exposure to ochratoxin A [J]. Cancer Lett，2016，372（1）：36-47.

[25]? 崔晉峰，吳莎，劉靜，等.赭曲霉毒素A對體外培養人胃黏膜上皮細胞染色體的損傷作用[J].腫瘤防治研究，2014，14（6）：541-544.

[26]? 李素麗，周芳，張慶瑜，等.ZEB2基因3′UTR區轉染對人胃黏膜上皮細胞GES-1增殖、侵襲、遷移的影響[J].天津醫藥，2014，42（5）：401-405，513.

（收稿日期：2019-09-19? 本文編輯：劉明玉）