水環境中溶解性有機物溯源分析及分子結構表征概述

褚江勇，廖振良

(同濟大學 環境科學與工程學院，上海 200092)

0 引言

溶解性有機物(Dissolved organic matter,DOM)是區域乃至全球碳循環的關鍵組分[1]，水環境中的DOM主要來自于天然或人為源。天然有機物通過生物體的分解和降解，通過水圈、生物圈和地圈的各種生物、物理和自然過程產生。另一方面，人為源DOM通過人類活動(副產物(例如污水[2])和垃圾以及微塑料的降解[3])引入環境中。除了作為碳源外，DOM還參與各種生態功能，例如作為土壤和水生食物網中微生物的能量來源以及生物代謝的副產物[4]。通過與重金屬以及持久性有機污染物(POPs)結合，在溶解度、毒性、生物利用度、流變性和污染物分布中發揮重要作用[5]。DOM 的環境影響和環境行為已受到學術界的廣泛重視，已成為研究的熱點。由于 DOM 組成復雜，對其來源和組成的表征分析成為相關研究的關鍵所在。

當前對于DOM的研究主要側重于兩個方面，其一為溯源分析，給出DOM的來源信息；其二是分子特征的解析，主要是給出DOM結構上的細節信息(化合物的分類、官能團信息、分子式和元素組成)。溯源分析常用方法有穩定同位素比值，生物標記法，化合物特異性同位素分析和光譜分析(紫外和熒光)。對于分子表征技術而言，尺寸排阻色譜(Size exclusion chromatography)耦合碳、氮檢測器、熱解耦合氣質聯用(PY-GC/MS)、核磁(NMR)以及傅里葉轉換離子回旋加速質譜(FT-ICR-MS)是比較常用的手段。本文擬對當前DOM的分析方法進行闡述，以及目前存在的挑戰和未來可能發展的趨勢。

1 水環境中的DOM

DOM包含多種化合物分子(如多糖，氨基酸，腐殖質，木質素，纖維素，肽聚糖，蛋白質，飽和和不飽和烴，單寧，芳香族化合物)，并具有不同的極性(疏水性、兩親性和親水性)[6]。它代表了一種復雜的混合物，同時根據環境、地理、時間和水體深度表現出不同的差異性[7]。DOM本身的復雜性和反應過程的差別導致其反應活性的差異。 Boudreau和Ruddick[8]提出反應性連續模型，目前仍用于不同環境中DOM分解的闡述。 DOM來源廣泛，增加其成分的復雜性。從來源上看，DOM通常被歸類為異地或本地源。來自水生環境之外的天然異地來源包括來自陸地(例如維管植物，葉子，根系分泌物和土壤)以及大氣(例如沙塵暴)的物質。除此之外，人類活動在異地源中起著重要作用，例如有機肥料、未經處理的污水、火災、化石燃料中的黑碳、泄漏的石油和塑料浸出液等[9]都會影響環境中的DOM。在水體中產生的本地源DOM來自水生生物群(例如藻類，細菌，浮游生物，大型植物和浮游生物)，并且由自養和異養生物生成[10]。同時，DOM可以被去除和轉化，并且在整個生物地球化學循環和微生物循環中發揮重要作用[11]。由于DOM易受光化學作用影響，并且該過程可改變DOM性質，因此它可作為光敏劑，例如中間體二氧化碳(CO2)，一氧化碳(CO)和其他危險的活性氧物質的產生，從而對生物器官產生氧化應激。這些過程的作用能力通常由環境參數(例如溫度，pH，鹽度)決定，在時間和空間上具有不確定性。

2 溯源分析

2.1 穩定同位素比率

碳具有兩種穩定的天然同位素：12C(98.89%)和13C(1.11%)。自然環境中的物理、化學或生物過程可導致同位素的變化，從而導致原子質量在12C和13C的比值差異。例如，根據植物的類型(例如，C3，C4或景天酸代謝(CAM))和它們的特定光合成路徑，同位素比可能會發生變化。 C3植物呈現碳同位素組成13C的值(穩定同位素的比率)13C/12C以千分之幾(‰)報告，可通過元素分析儀與同位素比質譜儀(EA-IRMS)測得。穩定碳同位素比率被廣泛使用，并被認為是溯源(例如，異地與原地)和表征DOM在環境中的轉化過程的最有效方法之一[12]。前人的研究主要側重于在13C分析上。如今，穩定碳同位素比通常與穩定的氮同位素比率15N的分析相結合，以防止單獨使用13C示蹤劑存在重疊[13]。除這些方法之外，同位素混合模型，基于同位素質量平衡方程，可用于估算多源流域環境或暴風雨事件中的來源[13]。

2.2 生物標志物

分子生物標志物(例如，靶向有機化合物通過氣相色譜與質譜聯用(GC-MS)分析，提供了一種強有力的工具，可以識別DOM的來源和相關的生物地化過程，從而重建環境中的變化。迄今為止，木素-酚(例如：木質素)，植物色素(例如：葉綠素和類胡蘿卜素)，碳水化合物，蛋白質和脂質已被最廣泛地用作識別DOM來源的生物標志物[14]。其中，脂類作為海洋的分子標記具有巨大的潛力，沿海河口系統以及內陸環境涵蓋多種DOM源成分(異生源，本地源和人為源)[15]。通過使用化合物比率和多變量統計工具有助于對DOM源追溯的準確性。

2.3 光學特性

DOM的吸光度和熒光特性被定義為與傳統生物標志物相當的“光學標志物”[16]。紫外可見光吸收和熒光已廣泛用于表征DOM中有色和熒光亞組分：CDOM和FDOM。 CDOM組分主要在紫外線中吸收光電磁波譜的(UV)和藍色區域。所選波長(aλ)的吸收系數用于不同目的。最常見的是a254，其計算用于估計CDOM的含量[17]。使用a350和a440是因為它們與木質素的強相關性[18]，應用于海洋顏色遙感[19]。一系列指數也被廣泛應用于吸收系數，以獲得平均分子量的信息(a250和a365之間的比率，E2/E3；光譜斜率比率Sr和分子的芳香性(254 nm處的特定紫外吸收，SUVA254)陸地化合物的追蹤(275和295 nm之間的光譜斜率，S275-295))。

FDOM是CDOM的一部分，可以發出熒光吸收UV-Visible光后。可以通過使用激發-發射波長(例如原位探針)，單發射光譜，同步光譜和三維激發-發射矩陣(EEM)來研究FDOM的光譜特性。此外， EEM耦合平行因子分析(PARAFAC)可以區分不同組的熒光團(組分)，如類腐殖質和類蛋白質組分[20]。通過使用特定波長或波長范圍內的熒光強度的比率，還開發了一組指數，主要用于區分本地和異生源，并評估DOM的腐殖化程度[21]。

熒光成分分布和光學指數已成功應用于研究DOM化學成分，確定來源并追蹤多種水生環境中涉及的生物地球化學過程，如廢水、河流、地下水、湖泊和海洋等。圖1展示的是熒光技術的具體流程，由于其低成本、快速、靈敏、預處理簡單并且處理數據方便，該技術現被認為是有效且標準的DOM研究工具。

3 分子結構表征

水環境中存在的溶解性有機物類型千差萬別，針對分子量的不同、分子中包含的官能團、化學鍵以及原子的差異，不同的分子結構表征手段被采用，大致可以概括為圖2。

3.1 尺寸排阻色譜技術

在線檢測器(OCD和OND)偶聯尺寸排阻色譜[22]技術，是當前應用于DOM分離中常見的方法。其使用純化的流動相(磷酸鹽緩沖液)和色譜柱(基于聚甲基丙烯酸酯的弱陽離子交換柱)，能夠根據分子量分離DOM[22]。 如今，它被認為是一種有吸引力的技術，可提供有關DOM(分子量分餾和DOC和DON濃度)的直接定性和定量信息。同時可以識別和量化五個確定的組分，包括生物聚合物(BP，>10 kDa)，腐殖質(HS，約1 kDa)，結構單元(BB，300-500 Da)，低分子量酸和中性物質(LMWA/N，<350 Da)[22]。如今該技術主要用于追蹤飲用水中的天然有機物或研究膜污染問題[23]。由于有機質的分子特征影響自然生態系統的反應性，尺寸排阻色譜耦合碳氮檢測器也成為表征自然環境中有機物的重要選擇之一[24]。

3.2 熱解耦合氣相色譜-質譜 (PY-GC-MS)

Py-GC-MS是一種化學分析方法，其中天然和合成生物聚合物被加熱分解產生字結構單元，即低分子量分子，然后通過氣相色譜分離并使用質譜法檢測[24]。

這種技術并不常用于表征DOM的分子組成，但它可以獲得有關天然有機物成分的詳細結構信息，以評估成巖作用和沉積物的來源[25]。

3.3 傅里葉轉換紅外光譜

FTIR是最常用的光譜儀之一，用于分析液體或固體天然有機物(NOM)樣品[26]。該光譜利用分子吸收其結構特征的頻率鑒別分子結構，例如，它們化學鍵的振動特性。由此產生的吸收是化合物的獨特指紋，可以識別官能團。通過樣品與KBr顆粒壓片產生的透射光譜是NOM研究中最古老和最常用的方法。另外，反射光譜作為衰減全反射(ATR)和漫反射紅外傅里葉變換(DRIFT)已被優先使用，因為該技術更可靠和非破壞性，并產生比前者更高的再現性。雖然這種技術具有許多優點適用于DOM和POM分數，現今很少單獨使用，并且優先與其他技術(例如NMR，熒光)結合使用，以支持與生化機制中的變化以及相關結果的解釋或控制質量。

3.4 核磁共振

核磁共振已被廣泛使用多年用于表征DOM中的分子結構，由于它能夠提供分子結構的詳細信息[27]。簡而言之，核磁共振是一種物理現象，磁場中的電核吸收并重新發射電磁輻射。核磁是一種高選擇性技術，可區分分子內許多原子或相同類型的分子集合，但僅僅用于周圍的化學環境。 NMR可以在固相和液相樣品上進行[28]，并且通常用于原子核1H，13C和15N[29]。傳統上，1維(1D)NMR用于表征DOM。然而，在過去十年中，NMR已被用于2維(2D)或多維配置，提供更加復雜的碳氫相關性信息，可用于表征更加復雜的有機化合物。

3.5 高分辨率傅里葉變換離子回旋共振質譜(FT-ICR-MS)

FT-ICR-MS已成為DOM復雜混合物的深入分子表征的可靠工具。在過去十年中，FT-ICR-MS在分子水平上的研究，包括湖泊、海洋、河口、濕地、土壤，河流甚至冰川在內的所有環境中DOM的化學表征都占據主導地位[30]。與電噴霧電離(ESI)相結合，提供必要的分辨率，以高精度確定數百至數千個離子，m/z范圍通常為200至1 000 Da。此外，由于高分辨率和準確度(小于0.5 ppm)，元素公式具有高置信度都使得FT-ICR-MS被廣泛用于DOM的研究。另一方面，由于ESI-FT-ICR-MS分析產生大量數據，經驗公式數據通常可將其分為6-8類主要化合物(例如，脂類，蛋白質，碳水化合物，不飽和烴，木質素和富含羧基的脂環族分子) (CRAM)，單寧和縮合芳族化合物)根據其H/C和O/C比例以及推測分子式中的原子差異(如圖3)。還開發了一些與不飽和度(DBE：雙鍵當量指數)和芳香性(AI或AImod：改性芳香性指數)相關的指數[31]。如今，該技術被認為是表征DOM的結構和分子特性最有強力的工具。

4 DOM研究的局限性

盡管每年都有大量關于DOM的研究，但上仍存在一些問題。DOM的組成在很大程度上存在不確定性以及許多影響其分析的固有問題存在。

(1)低濃度(如海水0.4～1 mg·L-1)：由于在某些水體當中含有大量無機化合物，可對當前的化學分析產生負面影響或干擾某些化合物的相對豐度[32]，從而增加了DOM研究的不確定性。

(2)化合物的極端多樣性和異質性，化學性質及其分子量的高度不確定性，使得分離和分析方法復雜化[33]。這為DOM分子特征及其來源分析的研究造成一定障礙，使其結構特征和溯源分析很難被精準把控。

(3)在分離或濃縮過程中難以提取無偏物質。盡管在過去十年中已經取得了顯著的進步，樣品的預處理，儀器分辨率和設備分析能力的改進，但大多數高度敏感的技術仍然存在一些不便(技術問題)，除了與數據處理相關的困難之外，還有令人望而卻步的成本。例如，穩定同位素比率的分析不需要太多的預處理，但它只能提供一個與有機物來源相關的值，而更先進的技術如FT-ICR MS分析提供數千種分子式通常不能夠被完全解釋。

5 未來的發展趨勢

針對前面所介紹的局限性，未來關于DOM的研究會是這些問題的不斷優化和完善：

(1)水體中DOM的含量較低，水中的無機物含量會對DOM信號干擾：未來對于水體中的DOM提取過程一定是更加簡單和便捷，針對現今固相萃取方式的缺陷，可能會出現某種特定的溶劑將水體中的DOM快速分離。出現更加高效的提取方式很好的實現DOM的富集。

(2)化合物本身的復雜性：現今出現的很多質譜技術已經能夠從某種程度上反映出DOM的分子特征，例如FT-ICR-MS、2D-NMR等。這些技術的出現已經能夠給出很詳細的結構信息，只是對于這些技術的分析比較復雜，很難將其給出的信息完全解析出來，并且該過程特別繁雜。未來的研究一方面側重于對于該分辨設備的開發，另一方面應該更多的傾向于數據庫的建立和完善。將得到的DOM信息(例如，熒光譜圖，質譜圖，核磁信息等)進行統一管理，通過不斷的完善數據庫本身，亦是在完善DOM本身，當數據庫建立到一定的程度，只需要將得到的DOM與數據庫進行比對即可得到全部的信息，從而大大減少沒有必要的重復工作。

(3)將DOM與其他技術相結合：當前對于DOM的研究主要側重于實驗層面的結構及其來源分析，對于DOM的研究具有一定的區域限制，很難被應用到大規模的實際工程領域中。未來的DOM研究可能會更傾向于DOM作為指示劑用于工程領域，與更加智能和高效的技術相結合。例如：衛星遙感技術。衛星遙感和生物光學擴展DOM分布，研究空間和時間尺度的補充方法是使用專為遙感和自主海洋平臺應用而設計的生物光學傳感器。 近年來，從衛星觀測中海洋表面的顆粒物質(PM)和CDOM的回收越來越受到關注，并且可以在全球范圍內對DOM動力學進行概要觀察。然而，目前用于檢索DOM的海洋顏色算法表現不佳，特別是在高DOM水域，如沿海地區和北冰洋[34]。此外，最近強調了將衛星遙感與數值水動力模型相結合的重要性，例如，可以將物理過程與沿海環境中水成分的分布和運輸聯系起來[35]。與此同時，將生物光學傳感器與DOM通道整合到海洋自動平臺(滑翔機，系泊設備，自動水下航行器，冰系帶剖面儀等)已成為最先進的技術，在過去幾十年中，監測工具允許在水柱上進行采樣，盡管有陽光覆蓋和天氣條件。這些傳感器不僅提供水柱上高度分辨的空間DOM覆蓋[36]，它們還收集更大的數據集以改進當前的海洋顏色算法。

6 結語

水環境中的溶解性有機物是區域乃至全球碳循環的關鍵組分，對于碳循環過程的理解是目前環境科學和生物地球化學領域的主要難題之一。 雖然在過去幾十年中對DOM的研究主要側重于溯源分析和分子結構特征解析，不斷有新的科技的加入，給水環境領域中的DOM研究帶來便利，但仍存在一些研究空白需要填補，并需要新的想法來不斷完善前人工作。未來的研究不應該僅僅著眼于溯源分析或是分子結構特征的表征，研究重點應該在不同的結構層面和不同的角度進行，更多的側重于實踐應用領域，將DOM作為一種指示劑與更新穎更智能的科技產品相結合，更精確地反映整個水環境特征，從而更加有效地為工程領域應用創造價值。