4株羊肚菌胞外多糖含量及其生物活性的研究

柏秋月，鄧百萬，，楊學英，解修超，劉軍生，羅陽蘭

（1.陜西理工大學陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001）

羊肚菌（Morchella esculenta），俗稱羊肚菜、羊肚蘑，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌目（Pezizales）羊肚菌屬（Morchella），是一種珍貴的食藥用菌[1]。研究表明，羊肚菌營養豐富，含有多種維生素、蛋白質和多種氨基酸[2]。羊肚菌還含有多種活性成分，如多糖、脂肪酸化合物[3]、礦物質[4]等，活性十分廣泛。其多糖成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抑菌等功效[5]。因此，羊肚菌在保健及醫學界中備受關注。且有文獻報道，真菌多糖具有良好的抗氧化作用，能夠有效緩解氧化壓力[6]。

但目前大多數抗氧化劑為人工合成，對人類健康有一定的危害，因此，尋求無毒無害的天然抗氧化劑成為了國內外研究的熱點[7]。現在對羊肚菌的研究主要集中在羊肚菌分類以及人工栽培等問題上，而有關陜南地區羊肚菌多糖成分生理活性的研究較少。

為此，本研究挑選了4 株于陜南地區生長較優的羊肚菌菌株為研究對象，通過液體培養并采用Sevag法[8]去除蛋白提取羊肚菌胞外多糖，檢測不同羊肚菌菌株胞外多糖水平是否有差異，并對其體外抑菌、抗氧化活性以及其對α-淀粉酶的抑制作用進行對比，旨在為羊肚菌藥食資源開發和利用提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的4 株羊肚菌（Morchella esculenta，編號為YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4） 菌種、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，菌株保藏號 CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，菌株保藏號 ATCC25925）、大腸埃希菌（Escherichia coli，菌株保藏號ATCC25922）、白色念珠菌（Candida albicans，菌株保藏號CM CC85021）：陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；維生素C（分析純，批號：20160105）：天津市天新精細化工開發中心；伏格列波糖片（批號172180801）：石家莊市華新藥業有限責任公司；DPPH、ABTS：Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

EYELAN100O 型旋轉蒸發儀：上海愛郎儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；KQ5200DE 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UA2550 型紫外分光光度計：日本島津公司；DYCZ-22A 型水平電泳儀：北京六一廠。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌菌種的培養

將供試的4 株羊肚菌在超凈工作臺中各取0.5 cm2接種于馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養基和察式培養基上，25 ℃，培養3 d～4 d。

1.3.2 羊肚菌菌種形態鑒定及內源轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）分子鑒定

將察氏培養基上的菌絲采用棉藍染色法在光學顯微鏡下對菌絲體的形態和大小進行鑒定[9]。

將PDA 培養基上培養的羊肚菌菌絲體利用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1 （5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS-4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmoL/L 上、下游引物各 2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 補至 50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，36 個循環；72 ℃延伸 10 min。4 ℃保存，備用；PCR 產物送上海生工生物工程有限公司測序，將測得序列提交NCBI 數據庫進行Blast 同源比對，使用MEGA7.0 軟件分析，使用Neighbor-Joining法構建菌株系統進化樹，確定菌株的分類地位。

1.3.3 羊肚菌多糖的提取

取供試的4 株羊肚菌在超凈工作臺中各取0.5 cm2接種于含PDA 液體培養基150 mL 的250 mL 三角瓶中，25 ℃，160 r/min 液體培養 6 d～7d 直至瓶中長滿菌絲球，進行抽濾，收集其濾液，用旋轉蒸發儀40 ℃濃縮至60 mL，并采用Sevag 法脫蛋白，取濾液與Sevag 試劑按 3∶1（體積比）置于 250 mL 三角瓶中，120 r/min 振蕩30 min，轉入分液漏斗中靜置30 min，重復3 次，取上層清液。真空濃縮至50 mL 后轉入三角瓶中，并加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜。3 500 r/min 離心10 min，45 ℃干燥至恒重，即得到羊肚菌胞外多糖。

1.3.4 羊肚菌多糖含量的測定

稱取0.100 0 g 預先干燥至恒質量的分析純葡萄糖，去離子水定容至100 mL，得到1 mg/mL 的溶液，取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，去離子水補至 10 mL，得到 10、20、40、60、80、100 μg/mL 的溶液，以去離子水為空白試劑；再取0.100 0 g 不同的羊肚菌胞外多糖，去離子水定容至10 mL，得到10 mg/mL 的溶液。

采用苯酚-濃硫酸法[10]測定總糖含量：分別取不同濃度的葡萄糖標品和不同羊肚菌胞外多糖溶液1 mL于試管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，混勻后沸水浴15 min，立即放入冷水中冷卻5 min，定容至10 mL，于490 nm 處測定吸光度，得到葡萄糖中總糖的線形回歸方程：y=0.041 3x+0.039 3，R2=0.997 4；采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖含量：分別取不同濃度的葡萄糖標品和不同羊肚菌胞外多糖溶液1 mL 于試管中，加入4 mL DNS，1 mL 去離子水。沸水浴5 min，立即置于冷水中，冷卻至25 ℃，定容至10 mL，搖勻，于540 nm 測定其吸光度，得到葡萄糖中還原糖的線形回歸方程：y=0.210 9x-0.019 8，R2=0.998 7。以上兩者之差即為羊肚菌胞外多糖的含量，計算公式為：

羊肚菌胞外多糖含量=總糖含量-還原糖含量

1.4 羊肚菌抑菌活性研究

采用濾紙片擴散法[11]研究羊肚菌多糖成分對致病菌的抑菌效果，將活化的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）稀釋于無菌水中制備成菌懸液，均勻地涂布在牛肉膏蛋白胨培養基上，以浸泡過無菌水的濾紙片為陰性對照組，以浸泡青霉素溶液（10 mg/mL）的濾紙片為陽性對照組，以羊肚菌胞外多糖溶液（10 mg/mL）的濾紙（直徑為5 mm）為樣品組，輕放在培養基表面，置于37 ℃恒溫箱中培養，24 h 后以十字交叉法測定抑菌直徑D，抑菌效果（E）按下列公式計算：

E=（D樣品組-D陰性對照組）/（D陽性對照組-D陰性對照組）

1.5 抗氧化活性的測定

1.5.1 還原能力的測定

參照文獻[12]，稍加改動，將不同的羊肚菌樣品配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品，加入1 mL pH6.6 的磷酸緩沖液、1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50 ℃水浴，反應20 min，然后加入1 mL 10 %的三氯乙酸，混勻后靜置10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和200 μL 0.1%三氯化鐵溶液，靜置 10 min 后測定OD700，以VC為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值。

1.5.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參照文獻[13]，稍加改動，將不同的羊肚菌樣品配制成 1、2、4、6、8、10 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取2 mL 的樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/LDPPH-乙醇溶液，混勻，放置 25 ℃暗處 10 min 后測定 OD517，以 VC為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按以下公式計算DPPH 自由基清除率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為2 mL 樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值；ASB為2 mL 樣品液+1 mL 99.9 %乙醇溶液的樣品對照組吸光值；AC為2 mL 去離子水+1 mL DPPH-99.9%乙醇溶液的空白組吸光值；ACB為2 mL 去離子水+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.5.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻[14]，稍加改動，將 7 mmol/L 的 ABTS 溶液和2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光條件下，25 ℃靜置過夜，形成ABTS 儲備液。使用前將ABTS 儲備液用無水乙醇稀釋（約稀釋50 倍），即OD734為0.7±0.02。將不同的羊肚菌樣品配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取 1 mL 樣品溶入2 mL ABTS 工作液，振蕩混勻，置于暗處5 min 后測定OD734，每樣重復3 次，取平均值，并按以下公式計算ABTS+自由基清除率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為 1 mL 樣品液+2 mL ABTS 工作液的樣品吸光值；ASB為1 mL 樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對照組吸收值；AC為1 mL 去離子水+2 mL ABTS工作液的空白組吸光值；ACB為1 mL 去離子水+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對照組吸光值。

1.5.4 羥自由基清除作用

參照文獻[15]，稍加改動，將不同的羊肚菌樣品配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL，最后加入1.2 mmol/L H2O2啟動反應，于37 ℃反應30 min，以去離子水調零在波長510 nm 處測定樣品吸光度A1；另以去離子水代替H2O2溶液重復以上操作，測定羊肚菌本身的吸光度值A2，同時以去離子水代替羊肚菌樣品測定吸光度A0，以0.1 mg/L 為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按以下公式計算羥自由基清除率：

清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.5.5 α 淀粉酶抑制作用的測定

參照文獻[16]，稍加改動，分別取不同羊肚菌樣品0.5 mL，加入0.5 mL 1 unit/mL 的α 淀粉酶溶液與0.5 mL 0.25%的淀粉溶液，混勻于37 ℃恒溫反應10 min，然后加入1 mLDNS 溶液，37 ℃恒溫反應5 min 后，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后用磷酸緩沖液定容至10 mL，測定OD575；以磷酸緩沖液代替α 淀粉酶作空白對照。以伏格列波糖片為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按以下公式計算α 淀粉酶活性的抑制率：

清除率/%=[1-（AS-ASB）/（AC-ACB）]×100

式中：AS為 0.5 mL 樣品液+0.5 mL α-淀粉酶溶液的樣品組吸光值；ASB為0.5 mL 樣品液+0.5 mL 磷酸緩沖液（替代α-淀粉酶溶液）的樣品對照組吸光值；AC為0.5 mL 去離子水+0.5 mL α-淀粉酶溶液的空白組吸光值；ACB為0.5 mL 去離子水+0.5 mL 磷酸緩沖液（替代α-淀粉酶溶液）的空白對照組吸光值。

1.6 數據處理與分析

使用MEGA7.0 軟件分析，使用Neighbor-Joining法構建菌株系統進化樹。

采用Excel 2010 軟件進行線性擬合，得到相關方程，計算相應的數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株菌落形態及顯微特征

羊肚菌菌落形態與顯微特征圖見圖1。

羊肚菌菌落形態及顯微特征：菌落邊緣整齊，菌絲緊貼培養基表面生長，氣生菌絲較少。在顯微鏡下觀察，菌絲呈竹節狀且具有分枝，有隔，分隔處縊縮，隔膜明顯加厚[17]。

圖1 羊肚菌菌落形態與顯微特征圖Fig.1 Morphology and microscopic characteristics of Morchella colonies

2.2 菌株序列分析

羊肚菌系統發育樹見圖2。

菌株 YS-Y 、XH-0、XH-2、XH-4 ITS 的擴增結果顯示其序列大小在800 bp 左右。

將以上4 株菌種ITS 序列測序后，提交至Gen－Bank 數據庫中，進行序列分析和相似性比較，并建立系統發育樹。由圖2 可知，菌株XH-0、XH-2、XH-4、YS-Y 與羊肚菌相似率達97%，說明4 株菌株屬于羊肚菌。

2.3 4株羊肚菌胞外多糖含量

根據1.3.4 的方法及計算公式，得出菌株胞外多糖含量如表1。

菌株 YS-Y 、XH-0、XH-2、XH-4 胞外多糖的含量分別為10.05%、5.80%、19.89%、8.34%。將數據進行方差分析結果表明P<0.01，各菌株胞外多糖含量差異極顯著。

圖2 羊肚菌系統發育樹Fig.2 Morchella phylogenetic tree

2.4 羊肚菌胞外多糖抑菌活性分析

陰性對照組紙片周圍無抑菌圈出現，表明水對細菌和真菌的生長無抑制作用。陽性對照組10 mg/mL 青霉素溶液周圍出現抑菌圈，且＞1 cm，表明試驗方法無誤且可行。4 種羊肚菌胞外多糖成分對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）抑菌程度不同，抑菌效果見表2。

表2 羊肚菌胞外多糖成分抗菌分析Table 2 Antibacterial analysis of extracellular polysaccharide components from Morchella sp.

上述研究表明，4 株羊肚菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果較好，對白色念球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果較差，菌株XH-2 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果最好，但對枯草芽孢桿菌無抑制作用，其余3 株對枯草芽孢桿菌的抑制效果較低。

2.5 4株羊肚菌抗氧化能力的評價

2.5.1 還原能力測定

羊肚菌胞外多糖的還原能力見圖3。

圖3 羊肚菌胞外多糖的還原能力Fig.3 Reduction ability of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖3 可知，4 株羊肚菌胞外多糖表現出不同程度的還原能力，且隨質量濃度的升高而逐漸增加，4 株羊肚菌以及 VC的還原力大小 VC＞XH-2＞XH-0＞XH-4＞YS-Y。當質量濃度由0.1 mg/mL 升至0.6 mg/mL 時，菌株XH-0 的還原能力變化最快；當質量濃度由0.8 mg/mL 升至1.0mg/mL 時，菌株XH-2 的還原能力變化最快，當質量濃度達到1.0 mg/mL 時，菌株YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4 以及 VC的 OD700吸光值分別為0.10±0.02、0.13±0.03、0.13±0.06、0.12±0.06 和 0.16±0.08。結果表明，菌株XH-2 胞外多糖的還原能力優于其他3 株，其次是菌株XH-0，但4 株羊肚菌的還原能力都不及VC。

2.5.2 DPPH 自由基清除能力的測定

羊肚菌胞外多糖的DPPH 自由基清除率見圖4。

由圖4 可知，4 株羊肚菌胞外多糖都具有一定的DPPH 自由基清除能力，隨著質量濃度的增加，其DPPH 自由基的清除能力也在不斷地增加，且呈現出明顯的劑量效應關系，4 株羊肚菌以及VC的DPPH 自由基的清除能力大小為 VC＞XH-4＞XH-2＞YH-Y＞XH-0，當質量濃度達到1.0 mg/mL 時，其清除率分別為72.30%、39.37%、39.24%、38.58%、34.32%；通過其關系進行線性回歸方程的擬合進而計算出YS-Y、XH-0、XH-2、XH-4 以及 VC的 EC50分別為 23.32、25.23、17.86、16.68、1.74 mg/mL。結果表明，菌株 XH-4 胞外多糖的DPPH 自由基清除率高于其它3 株，其EC50為16.68 mg/mL，這比鮑敏等[18]研究的羊肚菌胞外多糖對DPPH 自由基的清除率低，可能是由于提取工藝未優化，多糖活性受損導致的。

2.5.3 ABTS+自由基清除能力測定

羊肚菌胞外多糖的ABTS+自由基清除率見圖5。

圖4 羊肚菌胞外多糖的DPPH 自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

圖5 羊肚菌胞外多糖的ABTS+自由基清除率Fig.5 ABTS+free radical scavenging rate of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖5 可知，4 株羊肚菌胞外多糖有著較強的ABTS+自由基清除能力，一般認為某種質的EC50低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[19]。其多糖成分對ABTS+自由基清除率隨著其質量濃度的增加，清除能力也不斷增加。4 株羊肚菌以及VC的ABTS+自由基清除能力大小為 VC＞XH-2＞XH-4＞XH-0＞YS-Y，當濃度達到1.0 mg/mL 時，其ABTS+自由基清除率分別為97.47%、75.25%、56.82%、43.18%、33.33%；4 種羊肚菌胞外多糖成分以VC的ABTS+自由基清除率通過線性擬合計算得出其 EC50分別為 0.49、0.56、0.87、0.97、1.91 mg/mL。結果表明，4 株羊肚菌都具有較強的ABTS+自由基清除率，菌株XH-2 的ABTS+自由基清除率高于其它3 株。

2.5.4 羥自由基清除能力的測定

羥基是一種對機體危害最大的活性氧自由基，它可以損害機體內所有的生物大分子，羥自由基不能被特異的酶促反應降解，因此，維持細胞和機體正常的功能必須清除羥自由基[20]。羊肚菌胞外多糖的羥自由基清除率見圖6。

圖6 羊肚菌胞外多糖的羥自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radicals of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta

由圖6 可知，4 株羊肚菌胞外多糖有一定程度的羥自由基清除能力，隨著質量濃度的增加其清除能力也不斷增強。4 株羊肚菌以及VC的羥自由基清除能力大小為 XH-4＞XH-0＞YS-Y＞XH-2 ＞VC。當濃度達到1.0 mg/mL 時，其羥自由基清除率分別為35.78 %、30.50%、30.34%、29.83%、23.94%，對羥自由基的清除率進行線性擬合并計算出其EC50分別為1.40、1.75、1.76、2.09、3.09 mg/mL。結果表明，4 株羊肚菌的羥自由基清除率高于VC，且菌株XH-4 的羥自由基清除率達到了75.25%，這與任嘉興等[21]研究結果相近，說明菌株XH-4 具有較強的羥自由基清除能力。

2.5.5 對α 淀粉酶抑制效果的測定

羊肚菌胞外多糖對α 淀粉酶的抑制率見圖7。

由圖7 可知，羊肚菌胞外多糖成分對α-淀粉酶有較強的抑制作用，并且隨著其濃度的增加，對α-淀粉酶的抑制作用也不斷增強。4 種羊肚菌胞外多糖以及伏格列波糖片對α-淀粉酶的抑制率從大到小排序為伏格列波糖片＞XH-2＞YS-Y＞XH-4＞XH-0，當濃度達到1.0 mg/mL 時，其抑制率分別為47.38%、35.04%、32.91%、32.20%、25.97%，對4 種羊肚菌胞外多糖以及伏格列波糖片對α-淀粉酶的抑制率進行線性回歸方程擬合，計算其各自的EC50分別為1.15、1.55、2.04、2.27、2.38 mg/mL，說明4 株羊肚菌對α-淀粉酶的抑制作用較強，菌株XH-2 對α-淀粉酶的抑制率優于其他3 株，但都低于伏格列波糖片。

圖7 羊肚菌胞外多糖對α 淀粉酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of extracellular polysaccharide from Morchella esculenta on alpha amylase

3 結論

4 株羊肚菌菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較好的抑制效果，菌株XH-2 對這兩種致病菌的抑制效果最好，這可能與羊肚菌的抗菌和抗病毒的活性成分有關。

采用Sevag 法提取的羊肚菌胞外多糖具有一定程度的抗氧化能力和對α-淀粉酶的抑制能力。4 株羊肚菌對羥自由基清除能力都高于VC，且當質量濃度達到1.0 mg/mL，菌株XH-4 羥自由基清除率達到了75.25%；菌株XH-2 的還原力為0.13±0.06，優于其他3 株，且與VC差異不顯著。且其菌株對ABTS+自由基的清除能力和對α-淀粉酶的抑制能力均優于其他3 株，其EC50分別為 0.56 mg/mL 和 1.55 mg/mL，其 EC50均低于10 mg/mL，表明其具有較好的還原力和清除能力。菌株XH-4 對DPPH 自由基清除能力高于其它3 株，其EC50為16.68 mg/mL。由此可知，菌株XH-2 和菌株XH-4 的抗氧化性以及對α-淀粉酶的抑制能力效果較好，可為開發羊肚菌的天然高效氧化劑提供一定的依據。

結果表明羊肚菌胞外多糖有一定的抗氧化作用以及抑菌效果，但本研究只對體外進行了抗氧化和抑菌能力測定，未在體內進行測定，因此需要進行后續試驗對羊肚菌胞外多糖在體內的生物活性進行驗證，并且未測定4 株羊肚菌菌株對致病菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，需要后續試驗進一步測定，以期為羊肚菌藥用資源開發提供一定的依據。