不同酵母菌株發酵藍莓酒有機酸的動態變化研究

屈嬡，滿都拉，孫子羽，忻勝兵，趙雪妮，袁文艷，陳忠軍

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

藍莓，屬杜鵑花科越橘亞科多年生落葉或常綠灌木，因果實多為藍色而得名。其果實為漿果，呈深藍色、果皮附白霜、近圓形、皮薄籽小，富含花青素和總酚等營養物質，具有極高的營養價值，具有防止神經衰老、增強心臟功能、明目及抗癌的獨特功效[1]。普遍來說，藍莓果實口感偏酸，對釀酒微生物有一定的影響，這也是發酵藍莓酒的開發生產中存在的主要問題之一[2]。有機酸的組成與含量決定藍莓果酒的風味和品質[3]，有機酸的含量、發酵過程中的演變與調控是藍莓酒品質控制的關鍵因素之一，因此檢測藍莓果酒中有機酸的變化極為重要。

藍莓酒的獨特釀造工藝和原料早造就了藍莓酒獨特的香氣特征。藍莓發酵釀造的果酒揮發性物質十分豐富，包括醇類、酯類、酸類、羥基化合物、酚類、內酯、萜等幾大類，它們氣味各異，并進一步通過增效、協同、分離和抑制等相互作用使果酒香氣呈現多種多樣的特點[4-6]。有機酸本身所具有特殊口味與酸味，使得其對果酒風味影響的重要性僅次于酯類。有機酸的存在，不僅可以加速多糖的轉化和果膠物質的分解，還能促進果酒的老熟和澄清[7-9]；能與酒精起酯化反應生成酯，使果酒具有酯香；能使果酒具有清涼爽口的風味[10-11]。另外，果酒中的酵母菌自身還能夠產生芳香活性化合物，而改善果酒的最后的香氣和風味[12]。以往對藍莓酒風味的研究主要是對成品酒體中的風味物質含量的研究，鮮見對藍莓酒發酵過程中有機酸和揮發性物質的動態變化的報道[13]。本研究對不同酵母菌發酵藍莓酒過程中跟蹤取樣，采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC） 法測定不同酵母發酵藍莓果酒過程中9 種有機酸含量，以及酒精發酵結束后藍莓果酒中的有機酸類物質，為進一步研究藍莓酒發酵過程中風味物質的形成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍莓：內蒙古根河野生資源開發公司。

菌株：T1、FK3-2、GF3 均從根河的野生藍莓基地的藍莓果皮獲取，T1 為實驗室篩選改良的耐高糖釀酒酵母菌株；FK3-2 為實驗室篩選改良的耐酸釀酒酵母；GF3 為實驗室篩選改良的耐高酒精釀酒酵母。

檸檬酸、檸檬酸鈉（食品級）、焦亞硫酸鉀、白砂糖（市售）、甲醇（色譜純）、草酸、酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸混合標準溶液（2.0 mg/mL）；草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸（分析純）：百靈威科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

FA2104N 電子分析天平：北京海天友誠科技有限公司；G7129A 液相色譜分析儀：Agilent Technologies Singapore；PHS-3C pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PO-100/PO-1000 單道移液槍：梅特勒-托利多上海儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

冷凍藍莓果→篩選→解凍→稱量→榨汁→酶解（加果膠酶）→調節成分（加偏重亞硫酸鉀、糖，調節pH值）→接種→主發酵→倒罐→后發酵→陳釀→澄清→成品

1.3.2 樣品的制備及檢測

取適量的冷凍藍莓果常溫解凍，解凍后用榨汁機打碎，經預試驗后確定用1∶1（體積比）比例的蒸餾水混勻，按照0.03 g/L 添加果膠酶恒溫酶解2 h，酶解完添加120 mg/L 的SO2，調整初始糖量為32.2 BX，調節發酵醪液初始pH 值為3.5，按照7%接種量分別添加活化好的 T1、FK3-2、GF3，在 28 ℃恒溫培養箱中發酵28 d 前發酵終止。再將前發酵結束的藍莓酒倒灌放入20 ℃恒溫培養箱中后發酵28 d，然后倒桶低溫冷藏陳釀澄清一段時間，最后得到高酒精度的藍莓酒。在樣品前后發酵期間每隔7 d 取一次樣，進行成分測定[13-14]。

1.3.3 液相色譜條件

取樣品25 mL，加入適量活性炭進行吸附，再使用真空抽濾機進行抽濾，最后用0.22 μm 級濾膜過濾。液相色譜條件：利用C18色譜柱分析9 種有機酸，選擇0.08 mol/L 磷酸二氫鉀（pH2.9）做流動相，流動相流速為0.30 mL/min，柱溫為40 ℃，紫外檢測波長為210 nm[15-16]。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中草酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中草酸的含量變化如圖1所示。

由圖1 可知，T1 酵母菌在前酵期結束階段草酸含量最高，而后酵過程中草酸有下降趨勢，其后酵結束后的酒體中草酸含量比初始發酵醪液中含量高；FK3-2 酵母菌在發酵過程中的草酸含量變化趨勢與T1 酵母菌相似，但比T1 酵母菌的含量少；GF3 酵母菌在發酵過程中后酵期14 d 時草酸含量最高，后酵期21 d 時含量最低，后酵結束時的酒體中草酸含量比發酵醪液中的初始含量高。綜上來看，3 種不同酵母后酵結束后都會導致藍莓酒液中的草酸含量增加，這與包蓉[17]的酒精發酵結束后草酸的含量都會有顯著增加的研究結論相一致。

圖1 藍莓果酒發酵過程中草酸含量的變化Fig.1 Changes in oxalic acid content during fermentation of blueberry wine

2.2 發酵過程中酒石酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中酒石酸的含量變化如圖2所示。

圖2 藍莓果酒發酵過程中酒石酸含量的變化Fig.2 Changes of tartaric acid content during fermentation of blueberry wine

從圖2 可知，T1 與FK3-2 酵母菌發酵過程中酒石酸的含量變化趨勢大體一致。在前酵期28 d 酒石酸含量有明顯差別，GF3 酵母菌發酵過程中酒石酸的含量變化較前兩者都大，后酵結束后酒體中的酒石酸含量遠遠高于初始發酵醪液中的酒石酸含量。綜合來看，后酵結束，酒石酸的含量都有所增高，這與包蓉[17]的酒精發酵結束后酒石酸的含量都會有顯著增加的研究結論相一致，且GF3 酒體中的酒石酸含量增高的比較顯著。

2.3 發酵過程中蘋果酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中蘋果酸的含量變化如圖3所示。

如圖3 所示，T1 酵母菌發酵過程中蘋果酸的含量變化趨勢最大，在前發酵期14 d 時含量最高，后酵期7 d 時含量最低；FK3-2 酵母菌發酵過程中蘋果酸的含量變化較穩定，在前酵期28 d 時蘋果酸的含量最低，后酵結束后，蘋果酸的含量與初始醪液相比有所下降；GF3 酵母發酵過程中蘋果酸的含量明顯增高，但在后酵結束后蘋果酸的含量與初始醪液相比也有所下降；綜上來看，3 株菌在發酵過程中蘋果酸含量變化趨勢各有不同，但在后酵結束后蘋果酸的含量都比發酵醪液中初始蘋果酸含量低，這可能是由于發酵過程中酵母菌具有代謝產生蘋果酸的功能[18]。

圖3 藍莓果酒發酵過程中蘋果酸含量的變化Fig.3 Changes of malic acid content during the fermentation of blueberry wine

2.4 發酵過程中α-酮戊二酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中α-酮戊二酸的含量變化如圖4 所示。

圖4 藍莓果酒發酵過程中α-酮戊二酸含量的變化Fig.4 Changes of α-ketoglutaric acid content during fermentation of blueberry wine

如圖4所示，T1、FK3-2、GF3 酵母菌發酵過程中α-酮戊二酸的含量變化趨勢走向基本一致。其中GF3酵母菌發酵過程中α-酮戊二酸的含量最高，后酵結束后，GF3 酵母菌發酵的酒體中α-酮戊二酸的含量最高，其次是T1、FK3-2 含量較低；藍莓酒發酵過程中α-酮戊二酸的含量的增加可以為果酒提供有機酸的豐富性，并為果酒具有很強的抗氧化能力奠定基礎[19]。

2.5 發酵過程中乳酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中乳酸的含量變化如圖5所示。

圖5 藍莓果酒發酵過程中乳酸含量的變化Fig.5 Changes in lactic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖5 所示，T1 酵母菌發酵過程中乳酸的含量最少，其次是FK3-2 酵母菌發酵過程中乳酸含量居中，GF3 酵母菌發酵過程中乳酸含量最高；后酵結束后，T1、FK3-2 酵母菌發酵的酒體中乳酸的含量與發酵醪液中初始的乳酸含量相比有少量增長，GF3 酵母菌發酵的酒體中乳酸的含量與發酵醪液中初始的乳酸含量相比顯著增高。綜上來看，整個發酵過程中乳酸的含量變化趨于增長的趨勢，這說明了乳酸是果酒發酵中波動較大的有機酸[20]。

2.6 發酵過程中乙酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中乙酸的含量變化如圖6所示。

圖6 藍莓果酒發酵過程中乙酸含量的變化Fig.6 Changes in acetic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖6 所示，T1 酵母菌發酵過程中乙酸的含量變化趨勢波動最顯著。在前酵期14 d 時達到最高，比兩者酵母菌同階段的乙酸含量均高出很多；FK3-2、GF3酵母菌發酵過程中乙酸的含量變化趨勢大徑相同；后酵結束后，GF3 酵母菌發酵的酒體中乙酸含量最高，其他兩株菌的乙酸含量幾乎相同。由以上結果來看，不同酵母菌發酵過程中的乙酸的含量變化趨勢不同。由于乙酸是果酒中具有揮發性的有機酸之一，過量的乙酸必然造成成品酒揮發酸值超標。不同釀酒酵母產乙酸的能力差異較大，因此發酵過程中所選用的酵母也是影響藍莓果酒中乙酸含量高低的一個重要因素[21]。而酵母產乙酸的能力還與發酵原料中糖的濃度密切相關，糖濃度越高，酵母發酵產生的乙酸的含量就越高。因此，對藍莓果酒而言，選擇較低的糖濃度進行發酵，可能更有利于其產品的質量。即使藍莓果酒酵母能夠產生一些乙酸，其產生水平也不會超過法規的限量[22]。乙酸物質是釀酒酵母在生長與繁殖過程所產生的次生代謝產物，乙酸次生代謝產物的含量是評定果酒優良品質的重要指標[21]。

2.7 發酵過程中檸檬酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中檸檬酸的含量變化如圖7所示。

圖7 藍莓果酒發酵過程中檸檬酸含量的變化Fig.7 Changes in citric acid content during fermentation of blueberry wine

從圖7 可以看出，T1 酵母菌發酵過程中檸檬酸的含量變化趨勢波動較小，FK3-2、GF3 發酵過程中檸檬酸的含量變化趨勢基本一致，在前酵期先大幅度增高再迅速降低，前酵期7 d 時GF3 酵母菌的發酵醪液中檸檬酸的含量明顯高于其它菌株；后酵結束后，3 種酵母菌發酵的酒體中的檸檬酸含量幾乎一樣，比初始發酵醪液中含量高將近一倍左右。據報道適當濃度的檸檬酸可以提高藍莓果酒中花青素的穩定性，其主要表現在以下兩方面：一方面是檸檬酸降低體系pH 值，使花青素處于穩定的陽離子狀態；另一方面檸檬酸與花青素中羥基發生酰化反應，降低其反應活性，提高藍莓酒的穩定性和抗氧化活性[22]，且對果酒酸味起較大貢獻作用，所以后發酵結束后的藍莓果酒的酸味口感有所提升[23]。

2.8 發酵過程中焦谷氨酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中焦谷氨酸的含量變化如圖8 所示。

如圖8 所示，T1、FK3-2 酵母菌發酵過程中焦谷氨酸的含量變化趨勢大體上基本一致，GF3 酵母菌焦谷氨酸的含量變化波動幅度較大，前發酵期28 d 時含量最高；后酵結束，三者發酵的酒體中的焦谷氨酸的含量都比初始發酵醪液中降低了很多，其中GF3 發酵的酒體中焦谷氨酸含量略高，而T1、FK3-2 酒體中的焦谷氨酸含量接近0。焦谷氨酸對皮膚有保濕作用，焦谷氨酸可以抑制酪氨酸氧化酶的活性，阻止“類黑素”物質在皮膚中沉積，有美白皮膚的作用，此外，焦谷氨酸還有角質軟化作用[24]，由此來看，GF3 酵母菌發酵的藍莓酒更益于人們飲用。

圖8 藍莓果酒發酵過程中焦谷氨酸含量的變化Fig.8 Changes of pyroglutamic acid content during fermentation of blueberry wine

2.9 發酵過程中琥珀酸的變化

3 種酵母菌發酵過程中琥珀酸的含量變化如圖9所示。

圖9 藍莓果酒發酵過程中琥珀酸含量的變化Fig.9 Changes in succinic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖9 所示，T1 酵母菌發酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動最小，FK3-2 酵母菌發酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動較大，在前酵期7 d 時琥珀酸的含量增長到最高，GF3 酵母菌發酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動最大；后酵結束后，GF3 酵母菌發酵的酒體中的琥珀酸含量最高。總體上來看，后酵結束，琥珀酸的含量增高。這一結果與趙國群[24]等的試驗結果一致。釀酒酵母在酒精發酵過程中，代謝消耗了部分草酸，同時產生乳酸和琥珀酸，在葡萄酒的酒精發酵過程中，酵母菌發酵過程中也會產生乳酸和琥珀酸。2.10 發酵過程中有機酸總含量的變化

3 種酵母菌發酵過程中有機酸總含量的變化如圖10 所示。

圖10 藍莓酒發酵過程中9 種有機酸總含量的變化Fig.10 Changes in the total content of nine organic acids in the fermentation of blueberry wine

在不同發酵階段不同酵母菌發酵醪液中的9 種有機酸總含量是有區別的，前酵期7 d 時含量均有增加，但是 T1 含量最低，GF3 含量最高；14 d 時除 T1 有所上升外，其他均大幅度下降；28 d 時3 株菌均達到第二個峰值，且GF3 含量最高；到后酵初期有機酸含量均下降，后酵14 d 時T1 和FK3-2 總酸含量均上升，而GF3繼續下降，后酵28 d 時T1 和FK3-2 總酸含量略有下降，均為12 g/L 左右，而GF3 達到較高值，為20.9 g/L。前發酵結束后3 株菌總酸含量均高于初始發酵醪液，其中GF3 最高，其他兩株非常接近。后發酵結束后T1和FK3-2 發酵的酒體中總酸含量仍沒有差別，而GF3發酵酒體中總酸含量最高，是其他兩種的兩倍以上，且總酸量低于前發酵酒。總之3 株菌株發酵結束后藍莓酒體中的9 種有機酸的總含量比初始發酵醪液明顯增高。且藍莓酒體中的主要有機酸含量因釀酒酵母的種類不同而有差別[25]。

3 結論

通過研究在發酵過程中有機酸含量變化發現，不同酵母菌株發酵過程中9 種有機酸的含量有著明顯的差異，且發酵各個階段9 種有機酸總含量變化趨勢也有所不同。前發酵結束時，3 株菌發酵的藍莓酒體中9種有機酸含量均高于初始發酵醪液，其中GF3 最高，T1、FK3-2 非常接近。后發酵結束時，3 株不同菌株酒體中9 種有機酸的含量低于主發酵結束時含量，均高于初始發酵醪液，且T1 和FK3-2 有機酸含量幾乎沒有差別，而GF3 發酵酒體中有機酸含量最高，3 株菌中GF3 發酵的酒體中9 種有機酸的含量及總含量都較高。檢測不同酵母發酵藍莓酒過程中有機酸含量的變化為選擇良好的藍莓酒發酵酵母奠定了基礎。