回收方法對鰱魚肌漿蛋白和功能特性的影響

陳夢迪，楊梅，馬儷珍，任小青

（天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津 300384）

魚肉中肌漿蛋白占總蛋白含量的20%～50%[1]，長期以來人們認為肌漿蛋白會干擾肌原纖維蛋白的凝膠化，因此，為了提高淡水魚糜制品品質，通常采用漂洗的方式去除魚糜中的肌漿蛋白，但這樣做會導致大量的肌漿蛋白流失到漂洗水中，不僅造成蛋白質資源的大量浪費，而且使周邊水環(huán)境富營養(yǎng)化，產(chǎn)生赤潮等環(huán)境問題[2-4]。因此，對大量的魚糜漂洗水進行處理，有效回收其中的蛋白質，不僅可減少蛋白質資源浪費，提高水產(chǎn)品附加值，同時使廢水循環(huán)利用成為可能，順應了水產(chǎn)品清潔化、高值化生產(chǎn)的趨勢。

近年來，越來越多的科研人員關注于如何將肌漿蛋白從魚糜漂洗水中進行回收及其應用，徐律等[5]利用等電沉淀法回收魚糜漂洗水中蛋白質，其回收率可高達83.33%；Huang 等[6]等究了間斷性加熱對魚糜漂洗水中蛋白質的回收效果，發(fā)現(xiàn)70 ℃為蛋白質凝聚的最佳溫度；Bourtoom 等[7]利用調節(jié)pH 值處理魚糜漂洗水以達到高的蛋白質回收率。Yongsawatdigul 和Piyadhammaviboon 等[8]發(fā)現(xiàn)羅非魚肌漿蛋白的添加破壞了蜥蜴魚魚糜的凝膠，Jafarpour 和Gorczyca 等[9]報道了鯉魚肌漿蛋白能夠增強魚糜的質地。但有關肌漿蛋白的微觀結構及功能特性研究報道相對較少。

本試驗研究不同回收方法對肌漿蛋白微觀結構和功能特性的影響，回收方法包括：35 ℃真空濃縮冷凍干燥、35 ℃真空濃縮-調節(jié) pH 值冷凍干燥、65 ℃真空濃縮冷凍干燥、65 ℃真空濃縮-調節(jié)pH 值冷凍干燥和調節(jié)pH 值冷凍干燥5 種方法，以期根據(jù)回收蛋白質的功能特性不同，從而篩選出對應的回收方法，為魚糜漂洗水中蛋白質回收及副產(chǎn)物利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚（2 kg～2.5 kg）：天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)市場，20 min 內運送至天津農(nóng)學院食品加工車間。

溴酚藍：天津市大茂化學試劑廠；甘油、Tris-HCl、甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉：哈爾濱市萬泰生物藥品公司；2，4-二硝基苯肼：上海申翔化學試劑有限公司；尿素：天津光復科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海藍技科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白：上海生物生工有限公司；甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉：美國Sigma 公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

酸度計（PB-10）：賽多利斯科學儀器有限公司；高速剪切分散乳化機（FA25）：德國弗魯克公司；紫外分光光度計（UV-1800）：日本島津公司；差示掃描量熱儀（DSC200F3）：德國耐馳公司；冷凍離心機（ST40R）：德國 Theromo Scientific 公司；旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；低溫泵（DW-5/20）：上海振捷實驗設備有限公司；飛納臺式掃描電子顯微鏡（Phenom G2 pro）：荷蘭飛納公司；傅立葉變換紅外光譜儀（Spectrum65）：美國 Perkin Elmer 公司；電泳儀（MINI 4）：美國伯樂公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚糜漂洗水制備

將新鮮鰱魚宰殺后采肉、攪碎，添加4 ℃的蒸餾水漂洗，且魚肉與水的質量比為1∶3，用高速剪切分散乳化機在 15 000 r/min 勻漿 2min，4 ℃下 10 000×g 離心后過濾，得到的濾液為魚糜漂洗水，用于回收肌漿蛋白。

1.3.2 試驗方案設計

1.3.2.1 指標測定方法

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜的測定

參考喻亞麗等[10]的方法。在干燥的條件下，取凍干的肌漿蛋白樣品1 mg，經(jīng)KBr 壓片，用Spectrum65 紅外光譜儀對樣品進行紅外掃描。掃描范圍為1 700 cm-1～1 000 cm-1。

1.3.2.3 掃描電鏡的測定

將不同處理方法得到的肌漿蛋白樣品凍干，隨后取樣品均勻涂抹在試樣盤上，通風櫥風干，進行噴金鍍膜處理，噴射儀工作距離50 mm，噴射時間3 min～5 min，鍍膜厚度大約20 nm。然后將試樣盤從鍍膜機中取出、放在掃描電鏡儀內，調整束斑位置和放大倍數(shù)、聚焦清晰后獲取微觀結構圖像。

1.3.2.4 總巰基含量的測定

總巰基含量的測定參考李鵬的方法[11]，吸取0.5 mL濃度為2 g/L 的蛋白質溶液置于2.5 mL 含8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸和0.02 mL 的Ellman’s 試劑（每1 mL Tris-甘氨酸中加 4 mg 5，5’-二硫基-2-對硝基苯甲酸）的離心管中。加入 20 μL 5，5’-二硫基-2-對硝基苯甲酸（5，5'-dithio bis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）計時反應25 min 后，立即在412 nm 下進行吸光度的測定。總巰基濃度計算使用摩爾消光系數(shù)13600 cm/（mol/L），被溶解的蛋白質含量使用考馬斯亮藍法測定。公式如下：

式中：A412為 412 nm 下的吸光度；1.36×104為摩爾吸光系數(shù)；106為摩爾基礎單位到mmol/L 和蛋白質從mg 到g 的單位轉換；C 為考馬斯亮藍法在595 nm 下測得的蛋白質濃度，mg/mL。

1.3.2.5 表面疏水性的測定

蛋白質表面疏水性的測定參照Chelh 等[12]的方法。將蛋白質溶于pH 為7.0，20 mmol/L 的磷酸緩沖液中得到蛋白質溶液濃度為5 mg/mL。準確吸取1 mL 的蛋白質溶液與 200 μL 的溴酚藍（1 mg/mL）混勻，室溫（25 ℃）下攪拌 10 min，然后 10 000×g 離心 15 min，將得到的上清液稀釋10 倍后，于595 nm 下測定溶液的吸光值 A，以磷酸緩沖液（pH 7.0，20 mmol/L）加 200 μL的溴酚藍（bromophenol blue，BPB）為空白樣品。計算公式為：

1.3.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

采用濁度法測定乳化性和乳化穩(wěn)定性[13]使用0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液配制5 mg/mL 蛋白質溶液，2 mL 大豆油與8 mL 蛋白質溶液于高速剪切分散乳化機下10 000 r/min 均質2 min。分別于 0 min 和 10 min 從底部迅速取出 50 μL，用 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀釋一百倍后，于500 nm 下測定吸光值。乳化性計算公式如下：

式中：A500為樣品吸光值；F 為樣品稀釋倍數(shù)，即100；C 為蛋白質濃度，即 0.005 g/mL；φ 為油相占體積比，即0.25。乳化穩(wěn)定性計算公式如下：

式中：A0為 0min 吸光值；A10為靜止 10min 吸光值。

1.3.2.7 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定

測定采用差示掃描量熱法，稱取10 mg～15 mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒做參比，保護氣為氮氣，流量為20 mL/min，升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍 10 ℃～200 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的傅里葉紅外光譜（fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的紅外光譜圖見圖1。

圖1 不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of sarcoplasmic proteins in fish mince wash water obtained by different recovery methods

酰胺Ⅰ帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）主要來自 C=O的伸縮振動，并且通常提供關于蛋白質二級結構信息[14]。由圖1 可知，不同回收方法都改變了肌漿蛋白的結構，只是不同回收方法導致肌漿蛋白的變性程度不同，從而導致FT-IR 在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強度不同。當魚糜漂洗水經(jīng)過35 ℃濃縮時，導致其輕微變性，因此LT 組在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強度低于crude 組；當魚糜漂洗水僅經(jīng)過65 ℃濃縮及調節(jié)pH 值處理后，變性程度增加，因此HT 組和pH 組在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強度低于Crude 組和LT 組，酰胺I 帶強度的降低表明了肌漿蛋白二級結構的展開。Yongsawatdigu 等[15]在研究調節(jié)pH處理馬鞭子肌漿蛋白時發(fā)現(xiàn)，調節(jié)pH 值使肌漿蛋白在酰胺I 帶的強度降低與本試驗結果一致。

Crude、LT、LT-pH、HT、HT-pH 以及 pH 組在酰胺Ⅰ帶的吸收峰分別為 1 625、1 624、1 622、1 623、1 622、1 623 cm-1，其中經(jīng)過加熱濃縮結合調節(jié)pH 值處理的肌漿蛋白的酰胺I 帶特征振動頻率低于其他幾組。可能是因為調節(jié)pH 值后，在極性環(huán)境中，受到氫鍵或者電子基團的作用，酰胺I 帶特征振動頻率會向低波數(shù)方向移動。

不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白二級結構含量的影響見表1。

表1 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白二級結構含量的影響Table 1 Effects of different recovery methods on the secondary structure of sarcoplasmic protein infish mince wash water

酰胺I 帶各處理組表現(xiàn)出的強度不同對應著其二級結構的變化。波數(shù)在1 650 cm-1～1 658 cm-1處峰面積代表α-螺旋的含量，波數(shù)在1 610 cm-1～1 640 cm-1處峰面積代表β-折疊的含量，波數(shù)在1 640 cm-1～650 cm-1處峰面積代表無規(guī)則卷曲的含量，波數(shù)在1 660 cm-1～1 695 cm-1處峰面積代表β-轉角含量[16]。對不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的傅里葉紅外光譜酰胺I 譜峰進行傅里葉自轉積譜分析，得到自轉積譜和相應的二級結構構象指認，結合Origin 里的Savitsk-Golay 函數(shù)得到各個峰區(qū)對應的面積，即為各結構的含量。由表1 可知，crude 組的肌漿蛋白中α-螺旋的結構含量為24.20%，β-折疊的結構含量為36.81%，LT 組和HT 組的α-螺旋以及β-折疊的結構含量均低于crude 組，加熱條件下α-螺旋含量降低代表蛋白質分子展開程度增加。

crude 組無規(guī)則卷曲含量為26.38%，β-轉角的結構含量為12.60%，其他幾組無規(guī)則卷曲和β-轉角的結構含量均高于crude 組，且經(jīng)過調節(jié)pH 值處理過的肌漿蛋白的無規(guī)則卷曲和β-轉角的結構含量均略高于未經(jīng)調節(jié)pH 值處理過的肌漿蛋白。正如張紅娟等[17]在研究pH 值對11S 球蛋白結構與凝膠性的影響時發(fā)現(xiàn)，pH 值為4.15 時11S 球蛋白的無規(guī)則卷曲含量比pH 值為7.5 時含量多，而α-螺旋的結構含量為0。

結合圖1 和表1 可知，不同回收方法得到的肌漿蛋白結構均有所變化，蛋白質結構由正常的α-螺旋和β-折疊轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲和β-轉角，使得蛋白質結構越來越松散，疏水基團暴露從而使其表面活性增強，變性后的蛋白質有利于蛋白質的交聯(lián)。

2.2 不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的掃描電鏡分析

不同回收方法得到的肌漿蛋白的掃描電鏡圖像見圖2。

圖2 不同回收方法得到的魚糜漂洗水中肌漿蛋白的微觀結構圖Fig.2 Microstructure diagram of sarcoplasmic protein in fish mince wash water obtained by different recovery methods

由圖可以看出，crude 組蛋白質樣品（圖2 a～b）蛋白質表面比較平整，大部分呈塊狀稍有褶皺和微小的孔洞；LT 組蛋白質樣品（圖2 c～d）由大片的塊狀變成小塊狀，褶皺增加表面微小的孔洞增多，LT-pH 組蛋白質樣品（圖2 e～f）整體還是呈現(xiàn)塊狀結構，然而其表面結構與crude 組和LT 組樣品相比變得粗糙，細小的孔洞增多；HT 組蛋白質樣品（圖2 g～h），與 crude 組和LT 組相比表面褶皺增加，結構粗糙，與LT-pH 相比細小孔洞減少，大縫隙變多；HT-pH 組蛋白質樣品（圖2 i～j），與HT 組相比表面褶皺變少，孔洞密集呈蜂窩狀；pH 組蛋白樣品（圖2 k～l）表面結構已經(jīng)被破壞，出現(xiàn)大的孔洞呈絮狀。根據(jù)以上結果可知，加熱濃縮導致蛋白質結構發(fā)生變化，濃縮溫度由35 ℃增加到65 ℃，導致蛋白質聚集從而出現(xiàn)更多的褶皺；調節(jié)pH 值導致蛋白質白結構均出現(xiàn)不同程度的孔洞，說明熱處理和pH 值處理可破壞蛋白質的結構，使其從有序的結構變?yōu)闊o序的結構，這也對應著前文表1 的結果，經(jīng)過不同的處理，蛋白質結構由正常的α-螺旋和β-折疊轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲和β-轉角，使得蛋白質結構越來越松散。

2.3 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量的影響

不同回收方法對魚糜漂洗水中蛋白質的總巰基含量的影響如見圖3。

圖3 不同回收方法對魚糜漂洗水中蛋白總巰基含量的影響Fig.3 Effects of different recovery methods on the content of total sulfhydryl groups in fish mince wash water

巰基和二硫鍵是蛋白質中影響其功能特性的重要官能團。溫度、壓力以及pH 的改變都會引起二硫鍵的斷裂和巰基的變化，從而引起蛋白質構象的變化。由圖3 可知，與crude 組相比，LT 組的肌漿蛋白總巰基含量顯著提高（P＜0.5），由 50.36 nmol/mg 提升到147.36 nmol/mg；而當升高濃縮溫度時，HT 組表現(xiàn)出的蛋白質總巰基含量低于LT 組，說明在35 ℃濃縮的狀態(tài)下，漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量增加，而當濃縮溫度為65 ℃時，漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量顯著降低。這可能是因為經(jīng)受較高溫度的肌漿蛋白的構象變化導致SH 基團的暴露并通過氧化SH 基團或二硫化物交換形成二硫鍵，此結果與Sankar 等[18]的研究結果一致。

當魚糜漂洗水經(jīng)過調節(jié)極端pH 值處理時，肌漿蛋白的總巰基含量顯著低于crude 組（P＜0.5），而LT和HT 兩組經(jīng)過極端pH 值處理后，其對應的蛋白質總巰基含量也顯著降低，說明經(jīng)過調節(jié)極端pH 值處理后，可降低魚糜漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量，這可能是因為調節(jié)pH 值的過程中肌漿蛋白的結構發(fā)生了改變，導致巰基暴露氧化，從而使總巰基含量降低。Wang 等[19]等研究指出當?shù)鞍踪|pH 酸性調回中性時，蛋白質不能完全重折疊使得其結構發(fā)生改變，巰基暴露從而使巰基更容易氧化成二硫鍵。

2.4 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白表面疏水性的影響

不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白的表面疏水性的影響如見圖4。

圖4 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effects of different recovery methods on the hydrophobicity of sarcoplasmic protein surface in fish mince wash water

蛋白質的表面疏水性反映的是蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量，以溴酚藍可結合的疏水性氨基酸殘基的量來表示[20]。由圖4 可知，肌漿蛋白經(jīng)過加熱和調節(jié)pH 值處理都能增加其表面疏水性。LT 組蛋白質輕微變性，蛋白質結構展開，暴露疏水區(qū)域導致表面疏水性與crude 組相比顯著增加（P＜0.5），HT組比LT 組處理劇烈，從而使蛋白質變性程度增強，因此HT 組的表面疏水性顯著高于LT 組和crude 組（P＜0.5）。pH 組的表面疏水性為21.46 μg 顯著高于crude組的表面疏水性 74.73 μg（P＜0.5），這可能是由于表面帶有凈正電荷的蛋白質在靜電排斥的作用下使蛋白質分子展開，從而導致包裹在其內部的疏水基團和疏水殘基暴露在表面，進而使得表面疏水性增加，此結果與王偉等[21]的研究結果一致。HT 組的表面疏水性為57.15 μg 低于pH 組的表面疏水性，可是是因為在65 ℃濃縮在這一過程中，通過蛋白質-蛋白質的相互作用導致蛋白質不斷聚集，使暴露的疏水區(qū)域減少，導致其表面疏水性低于pH 組。

2.5 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of different recovery methods on emulsification and emulsion stability of sarcoplasmic protein in fish mince wash water

當魚糜漂洗水經(jīng)過不同回收方法處理時，肌漿蛋白分別發(fā)生不同程度的變性，處理越劇烈變性程度越高，因此使其乳化性與乳化穩(wěn)定性發(fā)生不同程度的升高。當魚糜漂洗水經(jīng)過35 ℃濃縮時，肌漿蛋白輕微變性，其乳化性為8.16 m2/g 與crude 組相比差異顯著（P<0.05），HT 組乳化性為 11.49 m2/g，乳化性與 crude 組和LT 組相比乳化性差異顯著（P<0.5）。熱處理會改善蛋白質的乳化性可能是由蛋白質變性引起的，通過升高溫度破壞改變蛋白質構象（范德華相互作用、氫鍵和靜電力）從而暴露一些疏水殘基，改變蛋白質分子的親水親油平衡從而提高乳化性與乳化穩(wěn)定性。經(jīng)pH值處理后，蛋白結構解折疊，疏水性氨基酸側面暴露增加，從而使肌漿蛋白乳化性能大大提升，使LT-pH組和HT-pH 組的乳化性與LT 和HT 組的乳化性相比分別提升了 3.82 m2/g 和 2.61 m2/g，而 pH 組與 crude 組相比乳化性由5.19 m2/g 提升到17.65 m2/g，乳化穩(wěn)定性由30.33%提升高53.59%。Jiang 等[22]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白再經(jīng)過pH 變換處理后，保持了原有的二級結構和整體的緊湊性，但失去了一些三級結構體，這些結構的改變導致乳化性的顯著改善，與本試驗結果一致。

2.6 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白熱穩(wěn)定性的影響

不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白熱變性溫度的影響見圖6。

圖6 不同回收方法對魚糜漂洗水中肌漿蛋白熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different recovery methods on thermal stability of sarcoplasmic protein in fish mince wash water

蛋白質的熱變性過程可以看作是溫度的動態(tài)函數(shù)。蛋白質在熱變性過程中，吸收熱量時由一個有序狀態(tài)變?yōu)闊o序狀態(tài)，破壞了分子內的相互作用，致使多肽鏈展開。當達到蛋白質的變性溫度時，在熱分析圖譜上會出現(xiàn)一個吸熱峰，由圖6 可看出所有回收蛋白質都有一個主要的吸收峰，代表了各組回收蛋白質的熱變性溫度點。crude 組蛋白質熱變性溫度為37.41 ℃，表明該使蛋白質在較低的溫度下就會發(fā)生熱變性。LT 組蛋白質熱變性溫度為75.52 ℃，HT 組蛋白質熱變性溫度為77.81 ℃，魚糜漂洗水在加熱濃縮處理時，肌漿蛋白已經(jīng)在35 ℃和65 ℃的條件下發(fā)生了結構的改變，在用差示量熱掃描法測定其熱變性溫度時，比未經(jīng)處理過的肌漿蛋白crude 組溫度要有所升高。李曉龍等[23]也發(fā)現(xiàn)熱處理會引起蛋白質分子二級結的等發(fā)生變化，導致蛋白質聚集交聯(lián)最終引起功能特性的改變。肌漿蛋白經(jīng)pH 值調節(jié)回收，表面攜帶了大量的凈正電荷，需要更高的溫度去克服靜電作用，因此與LT 組相比，經(jīng)過調節(jié)pH 值的肌漿蛋白過出現(xiàn)了熱變性溫度有所升高的現(xiàn)象，而HT 組回收蛋白質已經(jīng)由于加熱濃縮導致變性，從而使pH 組蛋白質變性溫度低于HT 組蛋白質的變形溫度。此結果與Tadpitchayangkoon 等[24]研究結果一致。

3 結論

5 種回收蛋白質與crude 相比均使肌漿蛋白在酰胺I 帶的波數(shù)向短波移動，對其所對應的蛋白質二級結構也有所影響，使α-螺旋和β-折疊的含量呈下降趨勢，而無規(guī)則卷曲的頷聯(lián)呈上升趨勢；對應著微觀結構可發(fā)現(xiàn)，crude 組蛋白質表面結構平整，隨著回收方法的不同其表面結構破壞程度不同，這與其無規(guī)則卷曲結構的相對含量是對應的，肌漿蛋白的無規(guī)則卷曲結構的相對含量越高，微觀結構破壞越嚴重。

LT、LT-pH 和HT 回收可使肌漿蛋白的總巰基含量升高，其中LT 組升高的最多，從50.36 nmol/mg 提升到147.36 nmol/mg；這幾種回收方法均可使肌漿蛋白的表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性有所提升，其中pH 組提升的最多，表面疏水性由21.46 μg 提升到74.73 μg，乳化性由 5.19 m2/g 提升到 17.65 m2/g，乳化穩(wěn)定性由30.33%提升高53.59%；HT-pH 熱變性溫度提升了最多，由37.41 ℃提高到108.28 ℃。