超聲波輔助提取藍莓葉總黃酮及對脂氧合酶的抑制

吳桂玲，胡麗，馮定坤，邢焰

（黔南民族師范學院化學化工學院，貴州 都勻 558000）

藍莓，又名越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium L.），為常綠灌木。在我國的四川、重慶，貴州、云南等地已有大面積種植，藍莓果實呈藍色，具有獨特的風味，并且營養豐富，但藍莓果實價格昂貴，從而限制了藍莓的廣泛應用[1-2]。藍莓葉作為藍莓的一種副產品，通常被丟棄，人們很少對它進行開發和利用，已有研究發現藍莓葉中含有總酚、原花青素等化合物[3-4]，同時還含有大量的黃酮類物質[4]。黃酮類化合物具有較好的抗氧化、抗衰老和增加機體免疫力、降血壓、降血糖、以及抗癌、抗腫瘤和抗突變等功能[5-6]，鑒于藍莓葉的這些功能，現已有把藍莓葉烘干作為茶飲用。現有研究發現黃酮類化合物在抑制脂肪酶活性等方面也有一定的效果，目前食品和醫藥品都在重點開發這個領域[7-8]。目前提取黃酮類化合物的方法主要有溶劑回流提取法[1，9]、微波輔助提取法[10-11]、超聲輔助提取法[12-14]，超聲輔助提取技術的高頻振動可以將細胞組織破壞，從而使浸提效果增強，可以使提取效率得到有效提高的同時將提取時間縮短，近年來已很好地用在天然植物有效成分的提取中。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗稱脂肪氧化酶、是廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中的一類非血紅素鐵蛋白。它專門催化具有順，順-1，4-戊二烯結構的不飽和脂肪酸的加氧反應，在植物體中脂氧合酶將亞油酸和亞麻酸轉化成氫過氧化脂肪酸[15-17]，最后由于其他酶的作用，產生了具有特殊風味的酯類物質[17]，比如說大豆的豆腥味，谷子的陳化[18]，還有研究表明小米中脂氧合酶活性會影響小米的儲藏穩定性[19]。茶葉中的LOX 主要在綠茶加工的初期起作用，比如茶鮮葉攤放的時候和殺青的過程中，LOX會影響綠茶的湯色、滋味、香氣等品質[20]，但是LOX 的殘留量過大會引起干茶的變質。已有研究發現茶葉產生陳味主要是由于茶葉中的LOX 引起的[20]，因此，可以在茶葉加工貯藏中盡可能的抑制LOX 的活性而達到有效貯藏的目的。通過之前的研究發現麻竹葉和馬蘭根黃酮類化合物可以抑制毛尖茶葉中的LOX 的活性[8，21]，為了開發更多的天然的LOX 抑制劑，本試驗以貴州麻江縣的藍莓葉為原料，用超聲波輔助提取法提取藍莓葉中的黃酮類化合物，用正交試驗優化提取工藝，以都勻毛尖茶葉為原料，提取了脂氧合酶，將藍莓葉中的黃酮類化合物對毛尖茶葉脂氧合酶活性進行了抑制性試驗。充分利用了藍莓葉資源并為天然抗氧化劑（黃酮類化合物）的提取及其對LOX 抑制機理的研究奠定了基礎，為尋找天然的LOX 抑制劑及研究茶葉的保鮮奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

藍莓葉，采自貴州省麻江縣，將藍莓葉洗凈置于DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥后取出用高速萬能粉粹機粉粹得最終樣品；毛尖茶葉采自都勻團山；蕓香葉苷（含量≥95.0%）：國藥集團化學試劑有限公司；吐溫20、純度為99.9%的亞油酸：阿拉丁；pH 6.3 的麥氏緩沖溶液：黔南民族師范學院化學化工學院301 實驗室自配，其他化學試劑均為分析純。

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；FA1204B 電子分析天平：上海精密儀器儀表有限公司；FW200A 高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；ps-20 超聲波清洗機：深圳市得康科技有限公司；SHZ-D（III）型循環水真空泵：鄭州予華儀器制造有限公司；GTR21-1高速冷凍離心機：上海趙迪生物科技有限公司；HH-S型數顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線制作

將蘆丁標準樣品在溫度100 ℃下干燥直至恒重，準確稱取樣品0.020 0 g，先加適量無水甲醇，使蘆丁完全溶解，再加無水乙醇，定容到100 mL，得到的蘆丁標準溶液，濃度為0.20 mg/mL。

從預先配好的100 mL 蘆丁標準溶液中分別量取0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL 依次置于 25 mL的容量瓶中，加入1.00 mL 質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液，充分搖勻，靜置6 min；再加入1.00 mL 質量分數為5%的硝酸鋁溶液，再次搖勻后，靜置5 min；最后加入10.00 mL 質量分數為4 %的氫氧化鈉溶液，搖勻，用無水乙醇定容，放置15 min 至20 min，在最大吸收波長500 nm 處測定溶液的吸光度A，以試劑作空白對照，記錄數據，用A 為縱坐標，c 為橫坐標繪圖，得到蘆丁標準曲線回歸方程為y=10.874 12X+0.008 6，相關系數 R2＝ 0.999 5。

1.2.2 藍莓葉黃酮類化合物的提取和含量測定

稱取處理過的藍莓葉粉末3 份，每份0.50 g，分別置于3 個錐形瓶中，分別進行超聲波輔助提取，將3 份提取液過濾，分別將濾液于5 000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清液稀釋至50 mL，備用。取適量待測液于25 mL 容量瓶中，按照1.2.1 測定蘆丁標準溶液濃度的方法，將藍莓葉總黃酮溶液置于紫外可見分光光度計中，測定溶液的吸光度A。根據1.2.1 得到的回歸方程，根據吸光度A 可以計算出藍莓葉總黃酮的含量。

1.2.3 單因素試驗

對藍莓葉黃酮類化合物提取條件所涉及到的4 個因素：乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間研究單因素的影響，每個因素選取3 個水平來進行正交試驗優化，得出最佳提取條件。1）乙醇濃度設定為40%、50%、60%、70%、80%、90%；2）料液比設定為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；3） 提取溫度設定為30、40、50、60、70 ℃；4）提取時間設定為 10、20、30、40、50 min。

1.2.4 超聲輔助提取工藝因素水平的確定

參照前期單因素試驗的結果，超聲波輔助提取藍莓葉中總黃酮的試驗主要考察乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）4 個因素，每個因素選3 個水平，采用L9（34）正交試驗，研究4 個因素對藍莓葉總黃酮提取率的綜合影響，最佳提取條件的確定是將藍莓葉總黃酮提取率定為考察指標。因素水平設計見表1。

表1 超聲輔助提取正交試驗因素水平表Table 1 The different levels of the factors in orthogonal test with ultrasound-assisted extraction of flavonoids

1.2.5 都勻毛尖茶葉中LOX 的提取

參照王海濱等[22]從茶鮮葉中分離提純LOX 的方法，略作修改。將新鮮的毛尖茶葉晾干后剪碎，稱取10 g 剪碎的茶葉，準確量取200 mL 的麥氏緩沖液與茶葉混勻2 min 后將混合液過濾，取濾液低溫高速離心5 min，取上清液，向上清液中加入固體（NH4）2SO4使溶液的飽和度為30%，在冰箱中靜置4 h。再次將溶液低溫高速離心5 min。取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的飽和度達到70%。將溶液放入冰箱中靜置24 h 左右，將溶液低溫離心10 min，進行過濾，將沉淀用麥氏緩沖溶液進行溶解，溶液即為茶葉的粗酶液，放入冰箱冷藏備用。

1.2.6 茶葉脂氧合酶活性測定

底物的制備：先配制10 mL 硼酸鹽緩沖溶液，使其pH 值為9.0，濃度為0.2 mol/L，然后取吐溫200.25 mL分散在緩沖溶液中，邊搖動溶液邊滴加亞油酸0.27 mL，充分搖勻，使它們混合均勻，再加入一定體積的濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液，邊加邊搖動，直到使整個溶液澄清，將溶液pH 值調到9.0，定容到500 mL 作為底物備用。

用分光光度法測定茶葉脂氧合酶的酶活性[23]。以溫度 50 ℃，pH 值為 6.3，15 mL 反應體系，其中底物為亞油酸鈉，以最大吸收波長234 nm 處的吸光度值每分鐘增加0.001 個單位定義為一個酶活單位。具體操作如下：15 mL 反應體系中含粗酶液1.0 mL，亞油酸鈉母液250 μL，以及緩沖液。在水浴中反應，水浴溫度為50 ℃，反應 2 min 時測 1 次 234 nm 處的 OD 值，反應4 min 時再測1 次，觀察兩次OD 值的變化，進行3 次平行試驗。以234 nm 處的吸光度值每分鐘增加0.001個單位定義為一個酶活單位。

酶活單位計算公式：A=1 000×[OD4min-OD2min]/2

式中：A 為酶活性單位；OD4min為反應4 min 的OD值；OD2min為反應 2 min 的 OD 值。

1.2.7 茶葉脂氧合酶的活性抑制性測定

在15 mL 反應體系中，加入已稀釋了的酶液1.0 mL，亞油酸鈉底物250 μL，再加入藍莓葉黃酮類化合物，黃酮類化合物分別取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，全部混勻后用pH 值為6.3 的緩沖溶液補足至15 mL，將反應體系在溫度為50 ℃的恒溫水浴中反應2 min，在紫外可見分光光度計上測定234 nm 處的吸光度，再繼續反應2 min，再次測定234 nm 處的吸光度。黃酮類化合物對LOX 的抑制率按下式計算：抑制率/%=[（A0-A1）/A0]× 100

式中：A0為無抑制劑時的酶活力；A1為加抑制劑時的酶活力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對藍莓葉總黃酮提取率的影響

在提取溫度40 ℃、提取時間20 min、料液比1∶30（g/mL）條件下，研究當改變乙醇體積分數時，藍莓葉總黃酮提取率的變化結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數對藍莓葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

由圖1 可知，當乙醇體積分數從40%開始逐漸增大時，相應的藍莓葉總黃酮提取率逐漸升高，在乙醇體積分數達到70%時，總黃酮提取率最大，當超過70%再升高時，總黃酮提取率反而降低，因此選擇60%、70%、80%為正交試驗中乙醇體積分數的3 個水平。

2.1.2 料液比對藍莓葉總黃酮提取率的影響

固定乙醇體積分數70%、提取溫度設定為40 ℃、提取時間定為20 min，進行3 次平行試驗，研究當料液比不同時，藍莓葉總黃酮提取率有什么變化，試驗結果見圖2。

由圖2 可知，當當溶劑用量逐漸增大即料液比逐漸減小時，藍莓葉總黃酮提取率也相應增大，在料液比 1∶40（g/mL）時，總黃酮提取率最高，之后隨著料液比的的減小，總黃酮提取率開始降低，因此選擇1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）為正交試驗中料液比的 3 個水平。

2.1.3 提取溫度對藍莓葉總黃酮提取率的影響

在固定乙醇體積分數70%、料液比1∶40（g/mL）、提取時間20 min 條件下，研究當超聲提取溫度不同時，藍莓葉總黃酮提取率的變化結果見圖3。

圖2 料液比對藍莓葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

圖3 提取溫度對藍莓葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

當提取溫度升高時，藍莓葉總黃酮提取率逐漸增大，當達到一個最大提取率后再升高溫度反而降低了，由試驗結果可知，總黃酮提取率最大時的溫度為60 ℃，因此選擇50、60、70 ℃為正交試驗中提取溫度的3 個水平。

2.1.4 超聲時間對藍莓葉總黃酮提取率的影響

選取乙醇體積分數 70%、料液比 1∶40（g/mL）、提取溫度60 ℃時，研究超聲時間改變時，藍莓葉總黃酮提取率的變化結果見圖4。

由圖4 可知，隨著超聲時間的延長，總黃酮提取率增大，到30 min 時達到最大值，30 min 之后其提取率反而降低，因此正交試驗中超聲時間這個因素選擇20、30、40 min 3 個水平。

圖4 超聲時間對藍莓葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

2.2 超聲輔助提取正交試驗

根據前面單因素試驗結果，綜合研究乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和超聲時間（D）4 個因素對藍莓葉總黃酮提取率的影響，設計L9（34）正交試驗設計，見表2。

表2 超聲輔助提取藍莓葉總黃酮正交試驗結果Table 2 The results of the orthogonal test for ultrasonic extraction of total flavonoids from blueberry leaves

由表2 可知，4 個因素對藍莓葉總黃酮提取率的影響大小順序為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間，可知對藍莓葉總黃酮提取率影響較大的因素是乙醇濃度，對總黃酮提取率影響較小的因素是提取時間。優化的提取工藝條件為A1B3C3D2，即乙醇體積分數60%，料液比 1∶50（g/mL），提取溫度 70 ℃，提取時間30 min，按優化工藝條件進行驗證試驗，經過3 次平行試驗，得到藍莓葉總黃酮的平均提取率為9.56%，比正交試驗表中的黃酮提取率都高，說明驗證試驗結果可靠。

2.3 茶葉脂氧合酶活性測定及藍莓葉總黃酮對茶葉LOX的活性抑制作用

按照1.2.6 的LOX 活性測定方法測得茶葉脂氧合酶的酶活力A=33.9。按照1.2.7 的LOX 活性抑制測定方法，結果顯示在水浴溫度為50 ℃，pH 值為6.3 條件下，藍莓葉黃酮類化合物可以抑制茶葉LOX 的活性，并且隨著總黃酮濃度的增大，抑制性也逐漸增強，結果見圖5。藍莓葉總黃酮：IC50=22.3 μg/mL。

圖5 藍莓葉總黃酮對茶葉LOX 的抑制性Fig.5 Inhibition of total flavonoids from blueberry leaves on LOX in tea

通過研究，發現密蒙花中的黃酮類化合物對大豆脂氧合酶有一定的抑制作用[7]，麻竹葉黃酮類化合物也可以抑制毛尖茶葉中的LOX 活性[8]。已有研究發現矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素可能對黑豆LOX 有一定的抑制性[24]。試驗發現藍莓葉總黃酮對都勻毛尖茶葉中的LOX 的也有一定的抑制作用。

3 結論

以乙醇為提取溶劑，超聲波輔助提取藍莓葉總黃酮，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化提取工藝，以總黃酮提取率為考核指標，在給定的試驗條件下，4 個因素對藍莓葉總黃酮提取率的影響的主次順序為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間，確定的最佳工藝條件為：乙醇體積分數60 %，料液比1∶50（g/mL），提取溫度 70 ℃，提取時間 30 min，按優化條件得到藍莓葉總黃酮的平均提取率為9.56%。相比于常規提取方法，超聲波輔助提取法操作簡單，還可節省提取時間，降低成本，還提高了總黃酮的提取效率。LOX 的存在會使食品發生色、香、味的劣變，會對綠茶的湯色、滋味、香氣等品質產生很重要的影響，還會降低食品的營養價值，因此發現LOX 的天然抑制劑至關重要，本試驗發現藍莓葉中黃酮類化合物也可以抑制毛尖茶葉LOX 活性。這為尋找天然的LOX抑制劑及研究茶葉的保鮮奠定了一定的理論基礎，同時還能充分的利用藍莓葉，避免資源的浪費。