酶法制備乳源鈣螯合肽及其特性表征

劉曉容，郭俊斌，廖婉雯，陳惠，陳泳怡，黃鉅才，林榕欣，劉飛，方祥，曹庸，苗建銀，

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東 廣州 510665）

鈣是人體必需的一種礦物質，其總重量占人體重的1%～2%，鈣可以調節心臟搏動，維持肌肉的收縮和神經沖動的傳遞，細胞分泌和凝血等生理過程，對人體的酸堿平衡、新陳代謝有很重要的作用。缺鈣會引發人體出現疾病，因此補鈣是必要的。人體的小腸上段呈酸性，鈣離子不易發生沉淀反應。而小腸下段pH值呈中性至堿性，鈣離子易與植酸、草酸和磷酸等結合生成不可溶的鈣鹽沉淀，又因鈣在小腸內呈離子狀態才能被吸收[1]，從而造成人體對鈣的吸收率降低[2]。如何提高鈣在小腸內的整體溶解度，從而提高人體對鈣的吸收率，目前已成為鈣在人體被高效利用的重要研究方向。

近年來對鈣離子結合肽的研究越來越多，如利用牛骨、羊骨、豬骨、魚骨等[3-7]進行酶解制備鈣螯合肽。酪蛋白又名干酪素，是一類典型的磷蛋白，經胰蛋白酶水解可制得大量的生物活性肽。其中的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）含有豐富的磷酸絲氨酸和谷氨酸[8-10]，在pH 值呈中性至弱堿性的人體小腸下段中，可與鈣離子螯合生成可溶性的鈣肽螯合物，提高整段小腸內的可溶性鈣的平均含量，從而提高人體對鈣的吸收率[11]。美國、日本已將其作為補鈣功能食品的原料，德國也將其列入藥典，而我國的研究還處于初級階段[12]。

本試驗通過對乳源酪蛋白進行酶解制備和優化，以期得到高活性鈣肽螯合物的最優酶解條件，并確定此條件下所得活性肽的分子量分布，對最優酶解產物及其螯合物進行了氨基酸分析、紫外-可見光譜和紅外光譜分析。本研究結果具有重要的應用價值和潛在的商業價值，可以為后續鈣補充劑的研究和應用奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酪蛋白、胰蛋白酶（酶活為10 000 U/g）：廣州綠萃生物科技有限公司；無水氯化鈣：天津宏達化學試劑廠；鄰甲酚酞絡合劑：山東西亞化學工業有限公司；8-羥基喹啉、乙醇胺：天津大茂化學試劑廠；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

HQ45 恒溫搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；pH計：賽多利斯科學儀器（京）有限公司；DF-101S 數顯恒溫水浴鍋：鞏義予華儀器有限公司；L530 臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；AL104 電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EnVision 酶標儀：玻金埃爾默儀器有限公司；LC-8 分析型高效液相色譜儀：日本島津公司；SYKAM S-433D 氨基酸分析儀：德國賽卡姆公司；UV-240IPC 型紫外分光光度計：日本島津公司；Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白酶解液制備的工藝流程

溶解酪蛋白→調節pH 值和溫度→加入胰蛋白酶→恒溫酶解→滅酶→冷卻→調pH 值至等電點4.6→離心→取上清液測活性

1.3.2 酪蛋白與鈣的螯合反應處理

在10 mL 離心管中加入1 mL 5 mmol/L CaCl2和2 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.8），再加入 1 mL酶解液樣品，置于水浴搖床中37 ℃反應1 h 后，離心20 min（4 000 r/min），取上清液用于活性的測定。

1.3.3 鈣螯合活性的測定

采用鄰甲酚酞比色法[13]測定鈣螯合性。

1.3.3.1 標準曲線的制作

分別取標準鈣工作液（50 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 試管中，分別加一級蒸餾水補足1 mL，再各加工作顯色液5 mL 搖勻，8 min 內用酶標儀于570 nm 處檢測吸光值，建立標準曲線[13]。

1.3.3.2 活性的測定

取1 mL 稀釋8 倍的樣品于10 mL 離心管中，再加入5 mL 工作顯色液。置于渦旋機上搖勻20 s，在8 min內用酶標儀測定在570 nm 波長下的吸光值。將測得的樣品吸光值代入所得的標準曲線公式y = 0.012 9x +0.824 5（橫坐標為鈣含量/μg，縱坐標為吸光值，相關系數 r=0.967）。

鈣螯合量（μg/mL）=（X×n）/V

式中：X 為測得的樣品吸光值代入標準曲線所得的稀釋后的鈣含量，μg；n 為稀釋倍數；V 為樣品的體積，mL。

1.3.4 酪蛋白酶解工藝單因素試驗

根據預備試驗，本試驗酶解酪蛋白的單因素的基本條件定為：底物濃度6%（底物固液比g/mL）、酶用量0.6 %（酶與酪蛋白質量分數）、酶解pH 8.0 、溫度50 ℃。改變其中一個因素，保持其他因素不變，測定其鈣螯合活性。各因素水平梯度為：底物濃度4%、6%、8%、10%；加酶量0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；pH 7.5、8.0、8.5、9.0；酶解溫度 40、45、50、55 ℃；酶解時間 1、2、3、4、5、6 h。

1.3.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，將酶解時間固定為3 h，采用四因素三水平的正交試驗設計，以鈣螯合量為指標，著重研究底物濃度、加酶量、pH 值和溫度，篩選出最優水平組合。

1.3.6 最優酶解條件下鈣螯合肽的制備

取適量酪蛋白將其配成7%的底物濃度，用1 mol/mL NaOH 調節pH 值至8.7，加酶量0.8%，將酶解液于溫度53 ℃水浴搖床3 h 后，95 ℃水浴滅酶10 min，恢復到室溫25 ℃，用1 mol/mL HCl 調節pH 值至等電點4.6，離心 20 min（4 000 r/min），取上清液凍干。

1.3.7 最優酶解條件下鈣肽螯合物的制備

稱取一定量樣品，將其配成5%濃度，用1 mol/mL NaOH 調節pH 值 至7.0，按鈣螯合肽∶鈣（質量比）=2∶1 的比例加入無水氯化鈣，于50 ℃螯合反應1 h，取出冷卻至室溫25 ℃，加入5 倍體積的無水乙醇，4 000 r/min 離心10 min，取出沉淀，再用少量無水乙醇于4 000 r/min 離心10 min 洗滌沉淀，將沉淀烘干制得鈣肽螯合物備用[14]。

1.3.8 最優酶解條件鈣螯合肽的分子量測定

采用高效液相色譜法測定最優酶解條件下的鈣螯合肽分子量，流動相為（乙腈，含0.1%三氟乙酸）∶（水，含 0.1%三氟乙酸）=20∶80（體積比），檢測波長220 nm，進樣量 10 μL；流速 0.5 mL/min；色譜柱 TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；柱溫 25 ℃；配制0.1%（mg/mL）的肽混合標準品溶液，過膜后進樣，繪制校正曲線（Y=-0.311X+8.729 6，R2=0.997 2）；樣品從定容50 mL 的酶解液中取0.5 mL 溶解于10 mL 水中，配置成1.6 mg/mL 的樣品。

1.3.9 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的氨基酸分析測定

樣品的前處理參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品種氨基酸的測定》方法，準確稱取CPPs、CPPs-Ca 各 15 mg 于消化管中，加入 10 mL（6 mol/L）鹽酸并充入氮氣，于120 ℃烘箱中水解24 h，用氨基酸自動分析儀測進行氨基酸分析。

1.3.10 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紫外光譜測定

將最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物配制成1.0 mg/mL 的水溶液，在200 nm～600 nm 下進行紫外掃描。

1.3.11 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紅外光譜測定

分別將最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物粉末，50 ℃下烘至恒重，各取1 mg 晶體研磨后，加壓壓片，維持5 min 左右，卸壓得透明樣品片，用傅里葉紅外光譜儀在500 cm-1～4 000 cm-1區間內掃描。

1.3.12 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同底物濃度對鈣螯合活性的影響

底物濃度對鈣螯合活性的影響見圖1。

圖1 底物濃度對鈣螯合活性的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on chelating activity

如圖1 所示，在底物濃度4%～8%范圍內，隨著底物濃度的增加，鈣螯合活性也隨之上升。當底物濃度為8%時，其鈣螯合活性達到最大，為31 μg/mL。當底物濃度在8%～10%范圍內，其鈣螯合活性呈下降趨勢。這說明當底物濃度為8%～10%時，酪蛋白-胰蛋白酶體系存在著底物抑制的現象。有研究認為牛乳蛋白中存在著絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過與蛋白酶結合的過程，消耗掉部分酶，由于該種抑制劑與底物濃度的含量關系為正比，所以使得底物失去了與酶結合的機會[15]。酶解反應與底物濃度存在著密切的關系[16]。當底物處于較高濃度時，酶全被底物包裹著，反應體系的有效水分變少，阻礙了兩者的擴散，從而抑制了酶解反應的進行；當底物處于較低濃度時，底物與酶的有效距離增大，兩者的接觸面積減少，使底物的酶解受到抑制。因此，酶促反應都有其最適的底物濃度，本試驗確定的最優底物濃度為8%。

2.2 不同加酶量對鈣螯合活性的影響

加酶量對鈣螯合活性的影響見圖2。

圖2 加酶量對鈣螯合活性的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on chelating activity

如圖2 所示，當加酶量在0.4%～0.8%范圍時，鈣螯合活性隨著加酶量的增加而不斷升高，當加酶量為0.8%時，鈣螯合活性達到最高，為25 μg/mL。而加酶量大于0.8%時，鈣螯合活性有下降的趨勢。因為酶的專一性，底物先被分解成為小分子肽，小分子肽可以進一步分解為氨基酸，這是蛋白酶競爭結合的過程，而競爭結合作用在酶達到一定濃度后才被削弱，故增大加酶量能夠提高酶解效率[17]。當加酶量超過一定值，此時的底物大部分為小分子肽，蛋白酶競爭結合作用最弱，底物被酶飽和，酶解效率不再正比于加酶量，甚至出現下降的趨勢。

2.3 不同pH值對鈣螯合活性的影響

不同pH 值對鈣螯合活性的影響見圖3。

如圖3所示，當pH值在7.5～8.5范圍內，隨著pH值升高，鈣螯合活性幾乎呈直線上升，當pH 值為8.5 時，鈣螯合活性最大，其值為23 μg/mL。當pH 值在8.5～9.0 時，鈣螯合活性幾乎呈直線下降。由于pH 值能通過影響酶活性部位的有關基團、空間結構和中間復合物的解離，進而影響酶解效率[18]。另外，在pH 值為8.5時，鈣螯合活性達到最大值，這與胰蛋白酶最適pH 值相近。當高于或低于最適pH 值，胰蛋白酶的活性中心構象會發生變化，破壞其空間結構，從而使酶活性受到抑制[19]，所以最適pH 值約為8.5，酶在該范圍的作用效果最好，酶與底物結合力最強。此外，酪蛋白酶解過程pH 值會逐漸降低，所以維持酶解過程pH 值的穩定，對于酶解反應效率的意義重大。

2.4 不同溫度對鈣螯合活性的影響

圖3 pH 值對鈣螯合活性的影響Fig.3 Effect of pH on chelating activity

溫度對鈣螯合活性的影響見圖4。

圖4 溫度對鈣螯合活性的影響Fig.4 Effect of temperature on chelating activity

由圖4 可以看出，酶解液溫度為40 ℃～50 ℃時，鈣肽螯合量隨溫度升高呈遞增趨勢，并在50 ℃時達到最大值15 μg/mL，超過50 ℃時，鈣肽螯合活性降低。溫度能影響蛋白酶分子的穩定性[20]，酶分子的肽鍵存在著一定的空間構象，當酶解溫度低于其最適溫度，酶分子運動的活躍度減小，從而減少了蛋白酶與底物的接觸；當酶解溫度高于其最適溫度，會使次級鍵解離，致使酶失活，最終導致酶解效果減弱[21-22]。因此，胰蛋白酶在40 ℃～50 ℃范圍內能較好地發揮酶解活性，溫度過高，酶活性降低，鈣螯合活性也隨之降低。

2.5 不同酶解時間對鈣螯合活性的影響

不同酶解時間對鈣螯合活性的影響見圖5。

圖5 酶解時間對鈣螯合活性的影響Fig.5 Effect of time on chelating activity

由圖5 可知，在1 h～3 h 范圍內，活性肽的鈣螯合活性隨著酶解時間的增加而上升，在3 h 時達到最大值23 μg/mL，隨后呈下降趨勢。在酶解反應前期，由于底物處于較高濃度，酶活性強，酶解反應受到生成物的抑制作用較小，酶與底物能有效地結合，因此鈣肽螯合量增加得較快，當酶解3 h 后，增加酶解時間，反應物濃度減小，反應位點逐漸趨于飽和；產物濃度也逐漸增加，表現出越來越強的競爭抑制作用；與此同時，酶活性也會逐漸減弱；另外，中間復合物也逐漸達到穩態[23-25]。因此，酶解時間不斷延長，而底物則不斷被消耗，酶活性也不斷降低。所以，考慮到經濟效益，最適酶解時間約為3 h。

2.6 酶解工藝正交試驗結果及條件驗證

2.6.1 酶解工藝參數優化正交試驗結果

因素水平表見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

續表2 正交試驗設計及結果Continue table 2 Orthogonal array design with experimental results

由極差分析可知R（加酶量）＞R（底物濃度）＞R（pH 值）＞R（溫度），所以其對鈣螯合活性的影響次序大小為加酶量＞底物濃度＞pH 值＞溫度，由k 值可得最優水平組合為加酶量0.8%，底物濃度7%，pH 8.7，溫度 53 ℃。

2.6.2 最優組合條件驗證

稱取一定量底物濃度為7%的酪蛋白溶解，調pH值為8.7 和溫度至53 ℃后，加入0.8%的酶，恒溫酶解3 h 后經冷卻，離心等一系列處理后取得上清液測得的鈣螯合活性達到46.78 μg/mL，高于正交試驗中任何一個優化組合。

2.7 最優酶解條件下鈣螯合肽的分子量分布

最優酶解物的分子量分布見表3。

表3 最優酶解物的分子量分布Table 3 The molecular weight distribution of the optimum enzymolyte

由表3 可知，在最優酶解物中，相對分子于3 kDa以下的組分占92.11 %，相關研究表明[26]，分子量在3 kDa以下的多肽，不僅更易被人體吸收，而且含有多種生物活性，在人體內能發揮一系列的生理功能。此外，有研究表明[27-28]，活性肽的分子量越小，即肽鏈越短，鈣螯合能力越強，可能是因為較短的肽鏈的空間位阻較小，較容易與鈣離子發生配合反應；另一方面可能是因為較短的肽鏈有更多的鈣結合位點暴露，從而能螯合更多的鈣離子。因此，低分子肽制品越來越受到行業內相關人士的關注。

2.8 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的17種氨基酸分析

最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的氨基酸分析見表4。

表4 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的氨基酸分析Table 4 Amino acid analysis of calcium chelate peptides and peptide chelated calcium

由表4 可以看出，在最優酶解物中，谷氨酸含量最高，占16.81%，脯氨酸占9.46%，賴氨酸占7.33%，纈氨酸占6.92%，亮氨酸占6.92%，天冬氨酸占5.68%，且其必需氨基酸含量占總氨基酸含量的36.4%。螯合物中含量最高的谷氨酸，占23.3%，其必需氨基酸含量占總氨基酸含量的25.24%。當Ca2+與鈣螯合肽螯合時，會改變鈣螯合肽的空間結構，由于氨基酸的極性和側鏈基團之間存在一定的差異，導致與金屬離子的親和力也不同，所以Ca2+會與之親和力強的氨基酸的-NH2、-COOH 中的 N、O 形成配位鍵。Ca2+與氨基酸的配位，會改變氨基酸的總量，因此各種氨基酸的含量在螯合前后會有所變化[29]。有研究表明，與金屬螯合活性較高的有組氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等這幾種氨基酸[30-31]。通過螯合前后氨基酸組分的分析顯示，谷氨酸，絲氨酸和天冬氨酸的含量增加，說明谷氨酸，絲氨酸和天冬氨酸對鈣的螯合能力較強，可能是因為這三種氨基酸側鏈基團上的羧基與鈣離子發生更強的螯合作用，從而說明谷氨酸，絲氨酸和天冬氨酸的羧基是酶水解物與金屬離子的結合位點[32]。

2.9 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紫外光譜分析

最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紫外光譜分析見圖6。

圖6 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紫外光譜分析圖Fig.6 The UV spectra of calcium chelating peptides and peptides chelated calcium

紫外吸收光譜是基于物質的生色基團和助色基團的特性對紫外光譜的吸收，可用于物質的鑒定和結構分析。由圖6 可知，鈣螯合肽在230、272 nm 處的吸收峰在螯合鈣后藍移至222、274 nm，鈣螯合肽的主要成分為肽類和氨基酸，兩者的羰基在270 nm～300 nm范圍內有吸收峰[33]，鈣肽螯合物在270 nm～300 nm 處的吸光度相比于鈣螯合肽的明顯下降，可能是因為鈣離子與羰基發生了螯合反應，阻礙了羰基n→π*的電子躍遷，導致兩者能級之差增大，躍遷能量增加，吸收譜帶向短波方向移動，發生藍移，吸光度減弱。另外因為蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環存在著共軛雙鍵，故紫外光能被蛋白質吸收，實驗表明，最大吸收峰在280 nm 附近[34]。因此，酪蛋白酶解產物在272 nm 處有吸收峰。

2.10 最優酶解條件下鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紅外光譜分析

最優酶解條件下的鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紅外光譜分析見圖7。

如圖7 所示，鈣螯合肽在3 080 cm-1處有一個較寬的伸縮振動峰，為羥基的特征吸收峰，在酰胺C=O處伸縮振動的特征吸收峰1 730 cm-1附近有吸收峰，同時在羥基的面外彎曲振動的特征吸收峰955 cm-1處也有吸收峰，說明鈣螯合肽含有-COOH 結構。鈣肽螯合物的吸收峰相對于酶解產物發生明顯位移，峰形變窄，說明-COOH 結構已發生變化，-COOH 失去氫變成-COO-與鈣離子結合，這與闞文翰的結果相似[29]。此外鈣螯合肽在3 300 cm-1出現酰胺A 帶N-H 的伸縮振動吸收峰，在1 241 cm-1處有酰胺Ⅲ帶的N-H 變形峰，在1 125 cm-1處出現了C-N 的伸縮振動吸收，說明體系中有游離-NH2，這與林謝鳳的結果相似[35]。

圖7 最優酶解條件下的鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紅外光譜分析圖Fig.7 Infrared spectrum analysis of peptides and peptides chelated calcium

當氨基酸與金屬離子形成螯合物，金屬原子共用氮的電子對，增強了C-N 鍵的偶極性，在1 450 cm-1～1 000 cm-1出現較強的吸收峰[34]，比較鈣螯合肽和鈣肽螯合物的紅外光譜，可看出鈣肽螯合物的主要吸收峰相比于鈣螯合肽出現了位移，相對強度也發生了變化，這說明氨基酸的某些基團參與反應，受到激發，改變了振動頻率，說明鈣螯合肽與鈣離子發生了螯合作用。因為在最優酶解產物和鈣肽螯合物中，主要存在著氨基酸殘基之間的酰胺鍵和其末端或側鏈的氨基和羧基，故所呈現的紅外光譜圖不同，在紅外光譜中會有-COOH、-NH2的伸縮振動和變角振動等吸收峰[3]。

3 結論

本試驗研究通過單因素和正交試驗，優化得到酶法制備乳源鈣螯合肽最佳工藝參數，在此條件下所得酶解物螯合活性為46.78 μg/mL，分子量90%以上為3 kDa 以下的肽類；通過對比螯合鈣前后氨基酸組成變化，可知谷氨酸，絲氨酸和天冬氨酸對鈣螯合活性的貢獻較大；鈣螯合肽及其鈣肽螯合物的紫外光譜和傅里葉變換紅外光譜結果表明，兩者的化學結構在螯合前后發生了變化，其中磷酸基團參與了鈣螯合，其主要結合位點是-NH2、-COOH。