汽爆輔助酶解制備魚皮ACE抑制肽工藝優化

涂丹，張益奇，2，，張燕平，戴志遠，2

（1.浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 杭州 310035）

羅非魚是我國淡水魚養殖的主要品種之一，2017年產量達158.46 萬噸[1]。目前羅非魚的加工主要以冷凍魚片為主，導致大量魚皮、魚鱗等下腳料亟待處理[2]。近年來，國內外對魚類膠原蛋白的研究熱度逐年增加，主要集中在魚皮源膠原蛋白[3]、明膠[4]、生物活性肽的提取[5-6]、魚皮營養成分的分析[7]以及魚皮酶解產物功能特性等方面[8-10]。

膠原蛋白三股螺旋區域富含潛在的血管緊張素轉換酶（angiotension converting enzyme，ACE）抑制活性肽段，但難以被基質金屬蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]。為了暴露酶切位點，提高酶解效率，促進ACE 抑制肽的釋放，通常需要在酶解前對膠原蛋白進行預處理。膠原ACE 抑制肽制備通常直接以明膠為原料[12]、采用長時間熱處理[13]或使用大劑量酸、堿、酶制劑等[14]，但這些處理過程繁瑣、耗時長，甚至還會造成嚴重的環境污染。汽爆處理是近年來發展迅速的一種綠色、高效的新型物理預處理方法，該技術基于短時間高溫高壓蒸煮，使高壓蒸氣進入原料內部空隙，然后在極短的時間內爆破釋放，熱能瞬間轉化為機械能從而破壞蛋白高級結構[15]。前期研究發現汽爆處理能夠顯著提高魚皮蛋白質的溶出率和酶解效率。汽爆處理通過改變魚皮蛋白的結構進而影響其酶解進程，因而也就可能會改變蛋白酶酶解最優條件。

目前用于治療高血壓的藥物主要通過化學合成，如卡托普利、依那普利等，這些化學合成藥物降血壓效果雖顯著，但需要長期服用且會引起咳嗽、喪失味覺、腎功能下降等一系列副作用[16]。酶解天然蛋白資源制得的ACE 抑制肽具有安全性高、易吸收、毒副作用小且可長期使用而備受關注[17]。本文以羅非魚魚皮為原料，以酶解液ACE 抑制率和水解度為指標，通過單因素試驗研究汽爆處理條件和酶解條件對羅非魚魚皮酶解效率的影響，進一步通過響應面法確定了汽爆輔助酶法制備魚皮降血壓肽的制備工藝，以期為魚皮生物活性肽的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮：湛江環球水產有限公司；堿性蛋白酶（alcalase 3.0T，標稱活力為3.0 AU/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、馬尿酸（hippuric acid，HA）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管緊張素轉換酶（A6778-.1UN）、抑肽酶、細胞色素C、碳酸酐酶、桿菌肽等：美國Sigma 公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國 Tedia公司。

1.2 儀器與設備

400Y 多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司；QBS 200B 汽爆機：正道生物能源公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；DSHZ-300A 旋轉式恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；Fresco 21 冷凍高速離心機、EVOLUTION 60S 紫外分光光度計：美國Thermo Fisher 公司；QL-8bb-253旋渦振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；e2695 高效液相色譜：美國 Waters 公司；K-360 凱氏定氮儀、K-425 快速消解儀：瑞士BUCHI 公司；MLS-3781L 高壓滅菌鍋：日本Panasonic 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 汽爆羅非魚皮粉的制備

新鮮魚皮，剪成約5 cm×5 cm 大小，控制料液比0.1 g/mL，于 0.4%NaOH 溶液浸泡 2 h（4 ℃）脫去表面脂肪，流水沖洗3 h，經不同汽爆壓力處理一定時間，烘干，粉碎后冷藏備用。

1.3.2 羅非魚皮酶解處理

準確稱取一定量的羅非魚皮于酶反應器中→調節底物質量濃度至0.02 g/mL，55 ℃預熱10 min→堿性蛋白酶酶解→沸水浴滅酶10 min→8 000 r/min 離心10 min→上清液即為羅非魚皮酶解液。

1.3.3 酶解單因素試驗

以酶底比、酶解時間、pH 值和酶解溫度作為考察因素，以酶解液水解度和ACE 抑制率作為考察指標進行單因素試驗設計，每組試驗重復3 次。

1.3.3.1 酶底比（E/S）對羅非魚皮酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、pH 8.0、酶解時間2 h 條件下，設定不同的酶底比為：0.1 %、0.2 %、0.5 %、1.0 %和2.0%。

1.3.3.2 酶解時間對羅非魚皮酶解效果的影響

在酶解溫度 50 ℃、pH 8.0、酶底比（E/S）0.5%條件下，設定不同的酶解時間：30、60、90、120、180 min。

1.3.3.3 酶解pH 值對羅非魚皮酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、酶底比0.1%、酶解時間2 h 條件下，設定不同的 pH 值：7.5、8.0、8.5、9.0 和 9.5。

1.3.3.4 酶解溫度對羅非魚皮酶解效果的影響

在pH 8.0、酶底比0.1%、酶解時間2 h 條件下，設定不同的酶解溫度：45、50、55、60 和 65 ℃。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，依據Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken Design 設計原理，選取酶解溫度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）為 3 個考察因素，ACE抑制率（Y）為響應值，進行三因素三水平的試驗設計，以確定羅非魚皮最佳酶解工藝條件。試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.5 水解度的測定

采用OPA 法，根據Nielsen 等[18]方法適當修改。配制OPA 試劑（現用現配）：將7.620 g 四硼酸鈉和200 mg SDS 用150 mL 去離子水溶解，待完全溶解后加入4 mL溶有160 mg OPA 的乙醇溶液，混勻后再加入176 mg DTT，定容至 200 mL。

取400 μL 羅非魚皮酶解液，加入到裝有3 mL OPA 的試管中，混勻后靜置2 min，測定其在340 nm波長下的吸光度值。以純水作為空白組，100 mg/L 絲氨酸溶液代替樣品作標準曲線，根據標準曲線計算魚皮酶解液中游離氨基含量，并按照公式計算水解度（hydrolysis degree，HD）：

1.3.6 ACE 抑制率的測定

參照Wu 等[19]的方法并略作修改。用0.1 moL/L 硼酸緩沖液（pH 值 8.3，含有 0.3 moL/L NaCl）配制反應底物N-馬脲酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-histidylleucine，HHL，6.5 mmoL/L）和 ACE（100 U/L）。取適量魚皮酶解液稀釋至40 μL，與25 μL ACE 溶液混合并于振蕩器中混勻，37 ℃水浴保溫10 min，然后加入40 μL HHL 溶液啟動反應，37 ℃水浴繼續保溫 30 min，最后加入85 μL 1 moL/LHCl 溶液終止反應。反應溶液經0.45 μm 濾膜過濾后，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 分析測定反應中產生的HA 的量。

色譜條件：Waters e2695 HPLC 系統和 UV/Vis 檢測器，SunFire C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。上樣量10 μL，檢測波長228 nm，流動相為乙腈-0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）水溶液（30∶70，體積比），流速為0.8 mL/min。按照公式計算ACE 抑制率：

式中：A 為用純水代替酶解物參與反應條件下所產生的HA 的量；B 為酶解物參與反應的條件下所產生的HA 的量。

1.3.7 酶解液相對分子質量分布的測定

參照黃丹丹等[20]的方法并略作修改。取適量魚皮酶解液，經0.45 μm 濾膜過濾后上樣分析。色譜條件為：采用Waters2695 HPLC 系統和UV/Vis 檢測器，TSKgel G2000-SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh）色譜柱，檢測波長220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水溶液（0.1%TFA），流速 0.5 mL/min，進樣量 10 μL。相對分子質量校正曲線所用標準品為：馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（429 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6.5 kDa）、細胞色素 C（12.4 kDa）、碳酸酐酶（29 kDa）。

1.4 數據處理

試驗數據以平均數±標準差表示。采用SPSS17.0統計軟件進行方差分析（ANOVA），用Duncan 多重比較法進行顯著性檢驗（p<0.05）；應用Sigmaplot 12.5 進行數據整理、作圖，并用Design Expert 8 軟件進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 汽爆處理對羅非魚皮酶解效果的影響

酶解條件：酶底比0.1%、酶解時間2 h、pH 8.0 和酶解溫度50 ℃。在相同酶解條件下，以不汽爆處理為對照組，考察汽爆處理對魚皮酶解產物ACE 抑制率和水解度的影響，如圖1 所示。

圖1 汽爆壓力和保壓時間對魚皮酶解產物ACE 抑制率和水解度的影響Fig.1 Effect of steam explosion treatment on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of fish skin hydrolysate

由圖1A 可知，與對照組相比，汽爆處理后魚皮酶解液的ACE 抑制率和水解度都顯著增大（p＜0.05），而不同汽爆壓力間魚皮酶解液ACE 抑制率無明顯差異（p＞0.05）。綜合考慮汽爆樣品的均一性及水解度情況，選擇0.6 MPa 作為汽爆處理壓力。

由圖1B 可知，隨著保壓時間的延長，水解度不斷升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高后降低趨勢，當保壓時間為0.5 min 時達到最高（79.88%），比未處理組提高了27.14%，此時水解度比未處理組提高了1.8 倍。這可能是因為汽爆過程中，高溫高壓處理以及飽和水蒸汽瞬間泄壓產生的機械剪切力破壞了魚皮膠原蛋白高級結構，使得富含潛在ACE 抑制活性肽段的疏水區域暴露，有利于蛋白酶水解及ACE 抑制肽段的釋放。然而，過長的保壓時間可能會使已經生成的降血壓活性肽重新聚集或過度水解，從而導致ACE 抑制率下降[21-22]。因此，選擇汽爆壓力0.6 MPa，保壓時間0.5 min 進行后續的酶解參數優化。

2.2 酶解參數的選擇

酶底比、酶解時間、pH 值和酶解溫度對羅非魚皮酶解液ACE 抑制率和水解度的影響如圖2 所示。

圖2 酶底比、酶解時間、pH 值和酶解溫度對酶解產物ACE 抑制率和水解度的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

由圖2A 可知，隨著加酶量的增大，水解度不斷升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高再降低的趨勢，在酶底比為1%時ACE 抑制率達到最大值（92.25%）。黃嘉成等[23]用沙丁魚制備降血壓活性肽時也發現水解度過高反而使ACE 抑制率降低，可能是因為加酶量越大，水解度越大，同時釋放的ACE 抑制肽越多；然而加酶量過多時，酶分子與底物結合達到飽和狀態，對酶解液ACE 抑制活性影響減弱[24]。故選用1%作為最適酶底比。

由圖2B 可知，羅非魚皮酶解液ACE 抑制率隨酶解時間延長不斷升高（p＜0.05），120 min 時達到最高值（86.23%），進一步延長酶解時間，酶解液ACE 抑制率變化不明顯（p＞0.05），水解度則隨著酶解時間延長不斷上升。酶解時間過長，一些釋放的活性肽段可能在蛋白酶作用下進一步水解。故選用120 min 作為羅非魚皮的最佳酶解時間。

由圖2C 可知，隨著酶解體系pH 值增大，羅非魚皮酶解液ACE 抑制率和水解度都逐漸增加，且均在pH 8.5 時達到最高值，繼續增大pH 值，ACE 抑制率和水解度均呈直線下降。在不同pH 值條件下，蛋白質的解離狀態不同，與蛋白酶的接觸位點也不同，進而使得魚皮酶解產物不同[24-25]。故選用8.5 作為最適pH 值。

由圖2D 可知，酶解產物ACE 抑制率和水解度隨酶解溫度的升高也呈先上升后降低的趨勢，且均在酶解溫度55℃時達到最高值。這可能是因為每種蛋白酶都有其最適溫度范圍，超過最適溫度后，酶開始變性，使得酶解效率降低[26]。綜合以上單因素試驗結果，確定汽爆輔助酶解法制備魚皮降血壓肽的較佳工藝參數為：汽爆壓力0.6 MPa、保壓時間1 min、酶底比1%、酶解時間 2 h、酶解 pH 值 8.5、酶解溫度 55 ℃、pH 8.5。

2.3 響應面試驗

2.3.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗結果的基礎上，固定底物濃度為2 %、酶解時間為 2 h，選取酶解溫度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）3 個因素為自變量，以酶解產物ACE 抑制率（Y）為目標函數，根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理進行響應面設計，試驗設計方案和結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of the response surface experiments

續表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Design and results of the response surface experiments

對表2 進行回歸分析得到相應的二次響應面回歸方程：Y=94.53+2.47A-2.19B-1.34C-0.82AB-0.012AC-0.88BC-9.76A2-7.00B2-3.94C2。

顯著性方差分析的結果如表3 所示。

表3 回歸模型及方差分析結果Table 3 Regression model and analysis of variance

由表3可知，模型 p＜0.000 1，回歸模型極顯著（p＜0.01）；模型的一次項 A、B、C，二次項 A2，B2，C2，以及交互項 BC 對 ACE 抑制率影響極其顯著（p＜0.01），二次項 AB 對 ACE 抑制率影響顯著（p＜0.05），說明各因素對ACE 抑制率的影響存在一定的交互作用，并不是簡單的線性關系；失擬項p 值不顯著，表明模型擬合程度良好；根據F 值大小得出各因素對ACE 抑制率的影響順序為溫度＞pH 值＞酶底比；相關系數R2=0.998 0，模型的校正系數R2Adj=0.995 4，變異系數CV=0.58%，說明不確定因素對試驗結果的干擾較小，ACE 抑制率的變化有99.80%來源于所選變量，可以用此模型分析和預測汽爆輔助酶解制備魚皮ACE 抑制肽的情況。

根據回歸方程作響應面圖，考察所擬合的響應面形狀，分析處理因素對魚皮ACE 酶解液抑制活性的影響見圖3。

圖3 各因子交互作用對酶解物ACE 抑制率的響應曲面圖Fig.3 Response surface analysis of the influence on ACE-inhibitory by each factors

響應面圖可以反映各因素與響應值之間的關系，以及各因素間交互作用的顯著性，響應面圖坡度陡峭或平緩，反映響應值對于試驗因素的改變是否敏感。由圖3 可知，各因素中，酶解溫度對于魚皮酶解液ACE 抑制活性影響最為顯著，響應面坡度陡峭，隨著酶解溫度的升高，ACE 抑制活性呈先增大后減小趨勢；其次，酶底比響應面坡度相比pH 值稍平緩，pH 值比酶底比的影響相對顯著。這與方差分析結果一致，即各因素對ACE 抑制率的影響順序為酶解溫度＞pH值＞酶底比。

2.3.2 最佳工藝條件的確定

由Design-Expert 分析得最佳酶解條件為：酶解溫度55.66 ℃，pH 值8.42，酶底比0.92%。此條件下ACE抑制率理論值為94.97%。為方便驗證，將參數修正為酶解溫度56 ℃，pH 值8.4，酶底比0.92%，底物濃度2%，酶解時間2 h，進行3 次平行試驗，得到ACE 抑制率實際值為93.16%，說明模型與實際情況擬合較好，能夠較好的預測出實際ACE 抑制率。

2.4 羅非魚皮酶解液相對分子質量分布

在試驗所得的最優酶解條件下，采用堿性蛋白酶對汽爆處理前后魚皮進行酶解，酶解產物的相對分子質量分布曲線如圖4 所示。

圖4 魚皮酶解產物相對分子質量分布圖Fig.4 Gel filtration chromatograms of fish skin hydrolysate treated with alcalase under optimal conditions

由圖4 可知，未處理魚皮酶解后仍存在大量大分子蛋白質，其中4 000 Da 以上約占45.66%。汽爆魚皮酶解產物主要分布于307 Da～3 323 Da，其中2 000 Da～4 000 Da、1 000 Da～2 000 Da 和 300 Da～1 000 Da 分別占25.34%、21.64%和51.36%，不存在5 000 Da 以上的較大分子。這說明汽爆處理可顯著改善魚皮蛋白的酶解效果，使其降解成小分子肽段。

3 討論

化學合成降壓藥物對高血壓療效較好，但會引起咳嗽、喪失味覺、腎功能可逆性下降等副作用，天然蛋白源的ACE 抑制肽因其安全性高，易吸收等優勢被廣泛關注[27]。前人研究發現多肽C 端含有脯氨酸（Pro）或羥脯氨酸（Hyp）時具有較高的 ACE 抑制活性[20，28]。膠原蛋白三股螺旋區域呈（Gly-X-Y）n 周期性排列（其中X、Y 一般分別為Pro 和Hyp），因此膠原蛋白可能富含潛在的ACE 抑制活性肽段。但膠原蛋白三螺旋結構通過分子內及分子間氫鍵、范德華力、共價交聯等作用力相連接，難以被除基質金屬蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]。現有的膠原ACE 抑制肽制備工藝通常直接以提取的膠原、明膠為原料[12]、采用長時間熱處理[13]或使用大劑量酸、堿、酶制劑等[14]，這些處理過程繁瑣、耗時長，甚至還會造成嚴重的環境污染。因此急需尋找適于產業化的快速、簡便的膠原蛋白預處理方法，破壞其致密的三螺旋區域，提高酶解和ACE 抑制肽釋放效率。

通過適當、適度的熱處理破壞蛋白質分子的高級結構，使原料蛋白形成利于提取或控制酶解的亞基解離或聚集狀態，在此基礎上采用商品蛋白酶進行限制性酶解，是蛋白質物理改性研究中的熱點[29-30]。如Yang等[13]研究了高溫條件下軍曹魚皮明膠水解液的抗氧化特性；涂丹等[29]發現采用121 ℃預處理魚鱗蛋白，可顯著降低堿性蛋白酶的添加量和酶解時間；Min 等[31]發現水熱處理（150 ℃～250 ℃）可完全替代酸、堿、酶水解處理，用于豬皮蛋白水解液的制備。本研究采用汽爆處理羅非魚皮，高溫、高濕環境使得膠原蛋白分子間疏水鍵、氫鍵和某些共價鍵斷裂，使其三股螺旋結構變得松散，從而暴露出更多酶切位點，提高酶解效率。汽爆處理會改變魚皮蛋白結構進而影響其酶解進程，因而也就可能會改變魚皮蛋白酶解條件，為了提高魚皮多肽的得率，有必要對其酶解條件進行優化。

除原料預處理技術外，蛋白質酶解效果也與酶解溫度、酶添加量及水解時間等工藝參數密切相關。李敏雄等[32]采用堿性蛋白酶酶解羅非魚皮制備膠原蛋白肽，酶解最佳工藝條件為：時間7 h、加酶量7%、溫度60 ℃、pH 值10.38，此條件下羅非魚皮水解度可達23%，酶解液分子量集中在180 Da～1 000 Da。孔惠等[33]先后采用0.2%稀硫酸與1.0%檸檬酸復合處理，并結合水提法提取鮭魚皮明膠，進一步選用木瓜蛋白酶進行酶解處理，加酶量7%，pH 值8.0，水解時間2.5 h，此工藝條件下水解度為12.65%。本研究通過單因素及響應面試驗優化出羅非魚皮最佳酶解條件為：汽爆壓力0.6 MPa、保壓時間0.5 min、酶底比0.92 %、酶解時間2 h、pH 值8.4、酶解溫度56 ℃。與前人研究相比，本研究通過將魚皮明膠提取與酶解工藝有機結合，簡化了工藝路線，酶添加量更少，處理效率更高。

4 結論

本研究運用響應面優化汽爆輔助酶法制備魚皮蛋白ACE 抑制肽的工藝參數，并進一步分析了酶解產物的相對分子質量分布情況。結果表明，最優的工藝參數為汽爆壓力0.6 MPa、保壓時間0.5 min、酶底比0.92%、酶解時間 2 h、pH 值 8.4、酶解溫度 56 ℃。在此條件下酶解產物ACE 抑制率理論值為94.97%，實際值為93.16 %，其相對分子質量主要分布于307 Da～3 323 Da。本研究結果可為汽爆輔助魚皮酶解制備ACE 抑制肽的實際生產提供依據與參考，但本試驗只是初步研究了魚皮ACE 抑制肽粗提物的制備工藝，如何通過現代分離純化技術提高其純度和抑制活性有待進一步研究；此外，對于魚皮經汽爆處理后結構變化機制尚有待深入研究。