雙酶法提取甜瓜籽多肽的工藝研究

王思琪，傅晶依，丁修慶，劉佳鑫，趙珺

（長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022）

甜瓜因其味甘，性寒，具有清熱解暑，除濕止渴、利尿的功效，在我國廣受消費者喜愛，產量巨大。甜瓜籽即甜瓜的種子，據研究表明[1]，甜瓜籽中含有37.12%脂肪、24.08%蛋白質、24.50%糖類，0.01%維生素E 和一定量的礦物質，特別是鉀、鎂、磷[2]。但目前對甜瓜籽的利用極少，在一定程度上存在著浪費。研究發現，甜瓜籽蛋白質中多肽含量較高，氨基酸種類齊全，其中，賴氨酸的含量最高，含硫氨基酸次之，且通過酶水解可以有效改善蛋白的功能性質[7]，而目前國內外對甜瓜籽多肽的研究較少。

多肽是通過動植物蛋白酸解、酶解或微生物發酵獲得的生物活性多肽，是由氨基酸組成的小分子物質[3-4]。研究表明，多肽具有抗氧化、抗病毒、降血壓、免疫調節等眾多生理活性。此外，多肽還有易溶于水、易吸收、無毒副作用等特點[5-6]，近年來，受到了國內外研究者的廣泛關注。

本研究采用雙酶協同酶解法從甜瓜籽中提取多肽，并進行條件優化，為甜瓜籽的高效利用及其高值化產品的開發提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

甜瓜籽：天一種業提供；NaOH、HCl、甲醛：國藥集團化學試劑有限公司。堿性蛋白酶（8 U/g）、胰蛋白酶（2.5 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

數顯水浴鍋（HH-S2）、電子天平（PL203）：金壇市天竟實驗儀器廠；臺式高速離心機（H-2050R-1）、pH計（PHS-25）：長沙高新技術產業有限公司；精密定時電動攪拌器（JJ-1）：金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂甜瓜籽粉的制備

將500 g 甜瓜籽干燥至恒重后粉碎為粉末，用正己烷浸泡24 h 脫脂，將脫脂甜瓜籽粉末于50 ℃烘干，然后過80 目篩，得到脫脂甜瓜籽粉，存于室內陰涼干燥處備用[1]。

1.3.2 雙酶法制備甜瓜籽多肽

取脫脂甜瓜籽粉加入蒸餾水，在90℃下變性10min，冷卻至25 ℃后同時加入胰蛋白酶和堿性蛋白酶進行酶解，期間設定底物濃度、加酶量、酶的質量比、酶解溫度、酶解pH 值、酶解時間。酶解結束后在90 ℃高溫下滅酶10 min，最后5 000 r/min 離心20 min，獲得多肽水解液。

1.3.3 單因素試驗

影響水解度的因素有很多[8]，本試驗著重研究底物濃度、加酶量、酶的質量比、酶解溫度、酶解pH 值、酶解時間等條件下對水解度的影響。單因素試驗因素和水平如表1 所示。

表1 單因素試驗因素和水平Table 1 Factors and levels in the single factor design

1.3.4 響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，得出pH 值、溫度、加酶量這3 種因素對水解度的影響顯著，因此利用Design-Expert8.5 軟件進行響應面優化設計，以水解度為響應值，以pH 值、溫度、加酶量為因變量，設計三因素三水平響應面分析試驗，試驗因素和水平如表2 所示。

1.3.5 水解度的測定

取多肽水解上清液8.0 mL，置于燒杯中，加入60 mL 蒸餾水，加氫氧化鈉調節pH 值至8.2，再加入10 mL 中性甲醛溶液（pH 值為 8.1），用 0.1 mol/L 的NaOH 溶液滴定至pH 值為9.2，記錄消耗NaOH 溶液的體積V（mL）。同時取未酶解的相同濃度甜瓜籽肽液8.0mL，按上述方法做空白試驗，記錄所消耗的NaOH溶液體積V0（mL）。水解度計算公式如下：

DH/%=C×（V-V0）×0.014/N×100

式中：C 為 NaOH 溶液濃度，mol/L；V 為酶解液消耗 NaOH 溶液體積，mL；V0為未酶解液消耗 NaOH 溶液體積，mL；0.014 為氮毫克適當量；N 為底物樣品中總氮含量[9]。

表2 響應面試驗因素及水平Table 2 Factors and levels in the response surface design

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 底物濃度對水解度的影響

底物濃度對水解度的影響見圖1。

圖1 底物濃度對水解度的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

由圖1 可知，在加酶量為3 %、酶解時間為150 min、酶解溫度為 50 ℃、酶解 pH 值為 7.5，酶比為5∶5（質量比）時。隨著底物濃度由2%逐漸增大到3%時，水解度逐漸增高，達到最大值10.94%，隨著底物濃度的繼續增加，水解度呈下降趨勢，這是因為高濃度的底物對反應速率起著抑制作用[10]。底物濃度過高時，高濃度蛋白質分散在體系中，束縛了體系中水的流動性，限制了酶分子擴散，從而減小了酶與底物接觸的可能性，導致反應的水解度下降，而當底物濃度過低時，會減少蛋白酶和底物的碰撞機率[11]，使水解反應受到抑制，因此，最佳的底物濃度為3%。

2.1.2 加酶量對水解度的影響

加酶量對水解度的影響見圖2。

圖2 加酶量對水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the degree of hydrolysis

由圖2 可知，在底物濃度為3%、酶解溫度為50 ℃、酶解時間為150 min、酶解pH 值為7.5，酶比為5∶5（質量比）時。隨著加酶量由2%增加到4%時，水解度達到了最大值11.45%，當加酶量大于4%時，水解度降低呈平穩趨勢。這是因為當酶與底物作用位點達到了一個飽和點[12]，增加酶的用量使底物濃度降低，減少酶與底物結合的機會，所以，繼續添加酶對于水解度的影響不大。從酶解效果及成本的角度綜合考慮，4%為最佳加酶量。

2.1.3 酶解時間對水解度的影響

酶解時間對水解度的影響見圖3。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖3 可知，在底物濃度為3%、加酶量為4%、酶解溫度為 50 ℃、酶解 pH 值為 7.5，酶比為 5∶5（質量比）時。反應時間由60 min 延長到180 min，水解度不斷升高，180 min 時達到最大值12.24%，但當反應時間繼續延長后，水解度呈下降趨勢。這是因為大分子的蛋白質在復合酶的作用下，首先水解成多肽[13]，但是隨著時間延長，更多肽鏈進一步被水解為游離氨基酸，導致多肽含量下降，多肽水解度趨于下降[14]。綜合考慮，180 min為最佳的酶解時間。

2.1.4 酶解溫度對水解度的影響

酶解溫度對水解度的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由圖4 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時間為180 min、酶解pH 值為7.5、酶比為5∶5（質量比）時。當溫度由 40 ℃升至 50 ℃時，水解度達到最高值12.68%。當溫度持續升高時，水解度開始降低。這是因為溫度過高，酶失去了活性，酶解效果下降，導致水解度降低[15]。因此確定50 ℃為最佳的酶解溫度。

2.1.5 酶解pH 值對水解度的影響

酶解pH 值對水解度的影響見圖5。

圖5 酶解pH 值對水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由圖5 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時間為180 min、酶解溫度為50 ℃、酶比為5∶5（質量比）時。隨著體系 pH 值由 7.0 增大至 8.0，水解度達到最大值13.40%。隨著pH 值持續增加，水解度呈下降趨勢。原因是繼續增大pH 值會使溶液呈堿性，導致酶失活[16]，酶解速率下降，因此制備的最佳pH值為8。

2.1.6 酶的質量比對水解度的影響

酶的質量比對水解度的影響見圖6。

圖6 酶的質量比對水解度的影響Fig.6 Effect of enzyme mass ratio on the degree of hydrolysis

由圖6 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時間為180 min、酶解溫度為50 ℃、酶解pH值為8 時。隨著胰蛋白酶用量逐漸增大時，水解度也隨之增大，當胰蛋白酶和堿性蛋白酶的質量比為6∶4時，水解度為13.78%，達到最大值。當胰蛋白酶用量持續增大時，水解度開始下降，這是因為蛋白酶對所作用的反應底物有嚴格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋白質分子中特定的肽鍵，而不能作用于所有的肽鍵，繼續增加胰蛋白酶的量不會對水解度產生影響。因此，最適的胰蛋白酶和堿性蛋白酶質量比為6∶4。

2.2 響應面優化設計試驗結果

利用Design-Expert 8.5 軟件的中心組合設計[17]，以pH 值、溫度和加酶量為響應變量，水解度為響應值進行響應面試驗，結果如表3 所示，對表3 數據進行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數回歸模型。回歸方程為：

Y=14.07+0.628 1A+0.355 7B+0.913 2C-0.181 2AB-0.343 7AC-0.431 2BC-0.747 6A2-0.938 5B2-0.793 5C

表3 中心組合試驗設計與結果Table 3 Center combined design and experimental results

續表3 中心組合試驗設計與結果Continue table 3 Center combined design and experimental results

優化后方差分析表見表4。

表4 優化后方差分析表Table 4 Variance analysis after optimization

由表4 可知，二次回歸模型的F 值為22.2，P＜0.000 1，表明模型達到了極顯著水平；失擬項P =0.111 7＞0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況，回歸模型是適合的；通過對模型的可信度進行分析，決定系數R2為0.952 3，說明方程擬合度良好。試驗模型的校正系數為R2Adj為0.909 5，試驗結果有90.95%受試驗結果的影響，因此此結果可靠。根據方差分析表中的F 值可得，影響水解度因素的主次順序為加酶量＞pH 值＞溫度，即加酶量對水解度的影響最大，pH 值次之，最后是溫度。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項pH 值、加酶量對水解度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；模型中交互項溫度和加酶量對水解度的影響達到顯著水平（P＜0.05）；模型中二次項 A2、B2、C2對水解度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

水解度的等高線圖與響應面3D 圖譜見圖7～圖9。

圖7 溫度和pH 值對水解度影響的等高線圖和響應面圖Fig.7 Contour diagram and response surface diagram of the influence of temperature and pH on the degree of hydrolysis

圖8 加酶量和pH 值對水解度影響的等高線圖和響應面圖Fig.8 Contour diagram and response surface diagram of the influence of enzyme amount and pH on the degree of hydrolysis

圖9 加酶量和溫度對水解度影響的等高線圖和響應面圖Fig.9 Contour diagram and response surface diagram of the influence of enzyme amount and temperature on the degree of hydrolysis

響應面坡度越陡峭，說明試驗條件的改變對響應值越顯著[18-19]，該因素對水解度的影響越大；反之，則表明因素對水解度的影響越小[20-21]。由圖可知溫度與加酶量的交互作用對水解度的影響較大，其次為pH值和加酶量的交互作用，而pH 值與溫度的交互作用最不顯著。

優化所得的最佳工藝為：pH 值為8、酶解溫度為50 ℃、加酶量為4%，在此條件下的預測值為13.77%。

2.3 驗證試驗

為驗證響應面法所得結果的可靠性，對模型優化的工藝條件進行驗證。在pH 值為8、酶解溫度為50 ℃、加酶量為4%的條件下進行3 次試驗。因為試驗可能存在著誤差，得到的平均水解度為13.85%，與預測值相差極小。因此說明此模型能較好的預測水解度，此優化工藝條件可靠。

3 結論

以甜瓜籽為原料，探究從甜瓜籽中提取多肽的最佳工藝研究，分別研究了底物濃度、加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH 值、雙酶質量比對水解度的影響。通過單因素和響應面優化設計試驗，得到了在底物濃度為3%、加酶量為4%、酶解時間為180 min、酶解溫度為50 ℃、pH 值為 8、雙酶質量比為 6∶4 的工藝條件下，水解度達到最大值13.85%。此試驗為甜瓜籽的開發利用提供了理論基礎，為企業創造社會經濟效益提供了途徑，具有廣闊的開發利用前景。