空氣等離子體對面包酵母的生物學效應的研究

韓蕓嬌，肖霄，張彬，張媛媛

（石家莊學院化工學院，河北 石家莊 050035）

空氣等離子體屬于低溫等離子體的范疇，是在活化放電時激發形成的等離子體。放電裝置為電火花發射器，它的工作原理是利用高壓變壓器把220 V 交流電壓升高至2 500 V～3 000 V，使發射器兩電極間發生火花放電，產生高頻電，高頻電流饋送至串聯的諧振電路中，再經高頻變壓器升壓到180 kV～210 kV，最后在尖端電極上放射出強力火花。在大氣壓室溫環境下，電火花發射器作用于周圍的空氣，電火花發生器在空氣中發射火花弧光（肉眼可見紫色光），產生較為復雜的等離子體[1]。等離子體產生時間短，活性粒子對樣品作用后快速消失，使得等離子體具有作用效率高，操作方便，安全無污染等特點，這些特性拓寬了等離子體的應用領域。應用領域主要包括：改變高分子材料表面性質[2]、工業三廢的處理[3-4]、微生物滅菌誘變[5-6]等。等離子體形成過程中可以產生紫外線，能量粒子和帶電粒子[7]，使其可在醫用材料的表面滅菌、菌膜的清理、生化武器的消除等方面發揮作用。

目前，關于等離子體的生物效應的研究集中于細胞膜上的多糖和蛋白質的降解[8]，對細胞膜結構的致命的破壞[9]，并最終致使細胞裂解，內溶物溶出等。本試驗從生物學角度研究了空氣等離子體對面包酵母的作用效應。酵母是一種真核生物，細胞壁主要由D-葡聚糖和D-甘露聚糖兩類多糖組成，相較于細菌它的細胞壁更加堅硬。通過生物學效應的研究，為等離子體殺菌[10-12]及后續試驗等離子體微生物誘變[13]等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包酵母3G-28 實驗室保藏；酵母膏（生化試劑）、蛋白胨（生化試劑）、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖（分析純）：西隴化工股份有限公司；吉姆薩染液（分析純）：北京鼎國生物技術有限責任公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G-250（分析純）：北京博奧拓達科技有限公司；鹽酸（分析純）、乙醇（分析純）、磷酸（分析純）：北京化工廠。

恒溫培養箱（DHP-9052）：天津順諾股份有限公司；搖床（MX-YZ）：金壇市梅香儀器有限公司；超凈臺（SW-CJ-1Cu）：鄭州宏朗有限公司；紫外分光光度計（UV-6100BS）：上海美普達股份有限公司；高溫滅菌鍋（LX-B100L）：合肥華泰有限公司；電火花發射及檢測器：三魚電氣設備有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；3K15 高速冷凍離心機：美國Sigma 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體的培養

用接種環挑取一環實驗室保藏的斜面酵母菌種3G-28，無菌條件下接種于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基中[14-17]，置于恒溫搖床，30 ℃，150 r/min 培養 36 h，再于 4 ℃冰箱中靜置 3 h[18]，離心（3 000 r/min，10 min），無菌水清洗后，稀釋，均勻涂布在固體培養基上，放入培養箱中靜置，30 ℃培養24 h。挑取平板上單菌落接種于斜面培養基中，30 ℃，培養24 h 后，置于4 ℃冰箱中保存，每月定期傳代保存。

1.2.2 空氣等離子體處理方式

取適當稀釋后的菌液5 mL 置于內徑為71 mm 的培養皿中，液體深度為2 mm，將培養皿放置于電火花發射裝置下方，調整發射端與液面距離為1 cm，控制空氣等離子體處理樣品的時間分別為 0、1、2、3、4、5 min（操作過程中肉眼可見紫色光線）。

1.2.3 空氣等離子體對面包酵母細胞生長的影響

適當稀釋經過空氣等離子體作用后的菌懸液，取100 μL 均勻涂布在平板上，30 ℃靜置培養24 h，菌落計數并計算不同處理時間后菌液細胞的存活率，每個處理時間做3 組平行試驗。

1.2.4 菌液pH 值和溫度的測定

用pH 計和溫度計測定經空氣等離子體處理過的菌懸液的pH 值和溫度，每個條件做3 組平行試驗。

1.2.5 菌液pH 值對酵母細胞存活率影響的測定

用稀鹽酸調節菌液pH 值至3.05（空氣等離子體處理5 min 后的pH 值），與未調節pH 值的菌液分別經過適當稀釋后，均勻涂布在固體培養基上，30 ℃靜置培養24 h，計算菌落數。

1.2.6 細胞染色及生長狀態的觀察

吉姆薩染液的配制方法：稱取1 g 吉姆薩染料，加入66 mL 甘油，混合均勻，置于60 ℃恒溫水浴鍋中溶解2 h，取出冷卻，加入66 mL 甲醇，混合均勻作為吉姆薩原液，使用前將原液用磷酸緩沖鹽溶液稀釋十倍即可使用。

分別取適量經不同時間處理后的菌液涂于載玻片上，自然風干，用吉姆薩染液染色2 min，無菌水沖去多余染液，置于顯微鏡下觀察細胞染色情況。適當稀釋不同時間處理后的菌液，涂布平板，置于30 ℃培養箱中培養并觀察酵母菌的生長情況。

1.2.7 面包酵母胞外蛋白含量的測定

將經過不同時間處理的菌懸液離心（3 000 r/min，10 min），取出上清液，測定酵母細胞外蛋白含量，測定方法為考馬斯亮藍法[19-21]。

考馬斯亮藍法是測定微量蛋白濃度時的常用方法，該方法快速靈敏且定量測定。原理是在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250 與蛋白質結合時能夠改變染料最大吸收峰的波長，從465 nm 變成595 nm，溶液的顏色發生變化（紅色變藍色），進而測定波長為595 nm 處時光吸收的值，就可以計算求得其結合蛋白質的量。

1.2.7.1 試劑的配制

標準蛋白質溶液：用0.15 mol/L NaCl 溶液配制1 mg/mL 牛血清白蛋白溶液。

考馬斯亮藍試劑：稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg溶于50 mL 乙醇（95%）中，再加入100 mL 磷酸（85%），混和均勻后加入去離子水稀釋，至1 000 mL，配好的溶液置于避光處過夜，濾紙過濾后使用。

1.2.7.2 標準曲線的制作

取標準蛋白質溶液 10、20、30、40、50、60 μL 分別置于潔凈試管中，加水至1 mL，再加入5 mL 考馬斯亮藍試劑，混和均勻后靜置5 min，在波長為595 nm 處測定吸光值，3 組平行試驗。

1.2.7.3 樣品的測定

取適量待測樣品，按1.2.7.2 中方法處理，使測得樣品的吸光值在標準曲線的范圍內，以求得不同處理時間的胞外蛋白含量。

1.2.8 面包酵母胞外核酸含量的測定

將經過空氣等離子體作用不同時間的菌懸液離心（8 000 r/min，10 min），取出上清液，用紫外分光光度計分別測定不同波長下（260 nm 和280 nm）的吸光度值。核苷酸濃度計算公式如下[22]：

核苷酸/（μg/mL）=（11.87A260-10.4A280）×100/9

2 結果和分析

2.1 空氣等離子體對面包酵母3G-28細胞生長的影響

量取5 mL 菌液置于電火花發射裝置下方，作用不同時間，試驗結果如圖1 所示。

圖1 空氣等離子體處理面包酵母3G-28 細胞的存活曲線Fig.1 Survival curve of 3G-28 treated with the air plasma

空氣等離子體能夠對酵母細胞造成損傷并致其死亡，細胞的存活率隨作用時間增加呈下降趨勢。3 min時，酵母細胞的存活率為37.355%；4 min 以后存活率下降速率趨于平緩，5 min 時，存活率為29.797%。

2.2 空氣等離子體對3G-28酵母菌懸液pH值和溫度的影響

空氣等離子體對BY-3 酵母菌懸液溫度和pH 值的影響見圖2。

圖2 空氣等離子體對3G-28 酵母菌懸液溫度和pH 值的影響Fig.2 Effects of the air plasma on temperature and pH value of 3G-28

由圖2 可知，空氣等離子體的作用能夠使菌液的溫度和pH 值發生變化。作用5 min 后，菌液溫度由25.0 ℃升至31.1 ℃，上升5.1 ℃，此溫度范圍亦屬于酵母3G-28 的生長溫度范圍。同時，被處理后菌液的pH值隨處理時間的延長而降低，2 min 之前，pH 值下降較為明顯，隨后pH 值降低較為緩慢，5 min 時，由最初的5.25 降低至3.05。

2.3 菌液pH值對酵母3G-28細胞存活率的影響

pH 值對BY-3 細胞存活率的影響見圖3。

圖3 pH 值對3G-28 細胞存活率的影響Fig.3 Effects of pH on surviving number of 3G-28

由圖3 可知，當菌液的pH 值分別為3.05 和5.25時，酵母細胞的存活情況基本一致。說明在等離子體作用過程中，pH 值的下降并不是導致酵母細胞死亡的主要原因。

2.4 空氣等離子體面包酵母3G-28細胞染色及生長狀態的影響

處理后細胞染色觀察見圖4。

圖4 處理后細胞染色觀察Fig.4 Microscopic examination of stained BY-3 cells after the plasma treatment

由圖4 所示，細胞的染色包括化學的親和作用和物理的吸附作用，不同的細胞，細胞內成分不同，通透性也存在差異，這就使得細胞對不同染料所表現出的親和吸附能力有所不同，染色程度存在差異。試驗使用相同的染色方法對空氣等離子體作用前后的面包酵母3G-28 的細胞進行染色，在顯微鏡下觀察，發現經空氣等離子體作用后細胞染色會加深。處理5 min后的酵母3G-28 的細胞染色程度明顯大于處理1 min后的細胞染色程度。表明空氣等離子體的作用對酵母的細胞膜結構造成了破壞，使得細胞通透性發生了變化，通透性增加能夠使染料進入細胞更加容易。試驗中還發現，經空氣等離子體作用后，部分細胞呈現出一定的生長延遲現象，生長速度相較于對照組較慢。

2.5 空氣等離子體對面包酵母3G-28胞外蛋白的影響

蛋白質標準曲線見圖5。

圖5 蛋白質標準曲線Fig.5 Standard protein curve for routine protein assay

蛋白質標準曲線如圖5 所示，蛋白質濃度在10 μg/mL～60 μg/mL 的范圍內時，A595nm與蛋白質濃度的線性關系良好，y=0.008 7x+0.029 1，R2=0.995 0。空氣等離子體作用菌液不同時間所求得的面包酵母3G-28 的胞外蛋白含量如圖6 所示。

圖6 空氣等離子體對胞外蛋白含量的影響Fig.6 Change in extracellular protein concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由圖6 可知，隨作用時間的增加，胞外蛋白含量明顯增加，作用2 min 時，胞外蛋白含量增長緩慢，3 min后增速明顯加快。作用5 min 時，胞外蛋白含量達到35.21 μg/mL，與未經作用的3G-28 菌液相比，胞外蛋白含量增多了近1.5 倍，變化顯著。

2.6 空氣等離子體對酵母3G-28細胞胞外核酸的影響

空氣等離子體對BY-3 細胞胞外核酸的影響見圖7。

圖7 空氣等離子體對3G-28 細胞胞外核酸的影響Fig.7 Change in extracellular nucleic acid concentration of 3G-28 after the plasma treatment

由圖7 可以看出，隨著處理時間的延長，酵母3G-28 的細胞胞外核酸逐漸含量增加，5 min 時胞外核酸含量達到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2倍左右。

3 結論

本試驗研究空氣等離子體對酵母3G-28 細胞的部分生物學效應的影響，試驗發現：

1）在空氣等離子體作用下，酵母菌液的溫度和pH值均發生變化，作用5min，菌液溫度由25.0 ℃升至31.1 ℃，pH 值由 5.25 降低至 3.05，2 min 后，pH 值下降較為緩慢，但溫度和pH 值的變化并不影響菌落的生長情況；

2）作用5 min 時，酵母3G-28 細胞的胞外蛋白和核酸含量均增加，胞外蛋白含量為35.21 μg/mL，較初始值增加了1.5 倍，同時胞外核酸含量達到3.64 μg/mL，是原始菌液胞外核酸含量的2 倍左右；酵母3G-28 細胞的存活率隨作用時間增加呈下降趨勢，5 min 時，存活率為29.797%。

3）顯微鏡下觀察酵母3G-28 的染色細胞，隨空氣等離子體處理時間增加，染色逐漸加深。

空氣等離子體能夠對酵母細胞造成損傷并致其死亡，空氣等離子在試驗過程中可產生活性氧，會在一定程度上對菌體細胞的細胞壁和細胞膜造成破壞，使細胞內溶物溶出，如蛋白質和核苷酸。由此認為，空氣等離子體對酵母細胞的直接和間接作用產生的活性氧可能是使得酵母3G-28 細胞損傷和死亡的主要原因。