乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系提取洋蔥黃酮工藝條件研究

肖連冬，王瑩，李慧星

（南陽理工學院生物與化學工程學院，河南 南陽 473004）

黃酮類化合物是在植物中分布非常廣泛的一類天然產物[1]，現已確認結構的生物黃酮類物質約有5 000 種[2]。不同結構的黃酮可以作用于身體的不同器官，黃酮作為一種強抗氧化劑，其功效是多種多樣的，不僅可以清除體內的氧自由基，還能夠阻止細胞的衰老和退化，降低癌變的可能性，具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎、鎮痛、免疫調節、降血糖、治療骨質疏松、抑菌抗病毒、抗輻射等作用[3-6]。洋蔥又名蔥頭、圓蔥、球蔥，作為生活中常見的蔬菜，洋蔥不僅含有豐富的維生素和氨基酸，而且還含有大量黃酮類化合物，洋蔥中的黃酮類物質主要有黃酮類、黃酮醇類和花色素類，作為洋蔥中重要的活性物質，有著廣泛的生理活性作用[7-11]。因此，探索洋蔥黃酮提取方法、條件對有關功能食品開發、營養保健品生產及醫藥臨床治療方面有意義重大。

黃酮傳統的提取方法有水浸提法，乙醇浸提法和酶解浸提法等。水浸提法操作最為簡便，對環境影響較小，但效率低，收率低，雜質含量高；乙醇溶液浸提法耗時長，收率低；酶解法條件溫和，但耗時長，成本高[12]；雙水相萃取法，是一種新型液-液萃取技術，根據萃取體系性質不同，當物質進入雙水相體系后，由于其表面電荷、表面自由能和各種力的作用使其在上下兩相進行分配，從而得以分離[13]。其優點[14-15]：（1）雙水相萃取兼具提取和純化雙重功效，提取出的產物純度高，雜質少；（2）操作條件溫和；（3）界面張力小，利于兩相間物質傳質；（4）分相時間短，萃取效率高；（5）操作簡便，易于工業化等。因此該方法受到人們極大的關注，是一種很有發展前途的萃取方法。本試驗采用雙水相萃取法，研究乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系萃取洋蔥黃酮的工藝條件，確定各項主要技術參數，以期為洋蔥黃酮的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅皮洋蔥：市售；槲皮素（分析標準品）：上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

BSA124S 分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FW-100 高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；TDL·40B 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；DHG-9146A 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；SHA-C 水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；721 分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將洋蔥洗凈、切絲，放入干燥箱中50 ℃干燥后用粉碎機粉碎，過40 目篩。

1.3.2 雙水相相圖的繪制

采用濁點滴定法[16-17]繪制雙水相相圖。參照溶解度大小，配制質量分數為25%的磷酸氫二鉀溶液。向錐形瓶中加入一定質量的磷酸二氫鉀溶液，后滴加無水乙醇并充分振蕩至溶液渾濁，記下無水無醇質量，然后滴加蒸餾水至溶液澄清，記錄蒸餾水的質量，算出此時磷酸氫二鉀和乙醇在系統中的質量分數，即得相圖中的一個點。重復上述操作，繪制出相圖。

1.3.3 槲皮素標準曲線的繪制

準確稱取5 mg 槲皮素標準品溶解定容至25 mL，得到 0.2 mg/mL 的黃酮標準溶液。分別吸取 0、1、2、3、4、5、6 mL 黃酮標準溶液，各以50 %乙醇溶液補至6 mL，然后各加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min；再分別加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min；再加入10 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，充分混合后用50%乙醇定容至20 mL，靜置15 min。以0 mL 黃酮標準液試管為空白，在510 mm 下測定各個溶液的吸光值，建立標準方程，繪制標準曲線[18-19]。

1.3.4 洋蔥黃酮提取操作

在乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系中，上相為富乙醇相，下相為富鹽相，由于黃酮類物質極性較小而富集于上相，而極性較大的物質如多糖則多富集于下相，從而使洋蔥黃酮得以提取分離。收集上相中黃酮作為產物進行研究。具體操作為：配制總質量10 g 的雙水相體系，加入一定量洋蔥粉末，恒溫水浴振蕩萃取后，將其轉移到離心管，4 000 r/min 離心20 min，測定上相體積及黃酮含量，計算出提取率。

式中：Vt為上相體積，mL；Ct為上相黃酮濃度，mg/mL；M 為加入的洋蔥粉末的質量，g。

1.3.5 單因素試驗

以上相黃酮提取率為主要指標，分別考察不同因素對洋蔥黃酮提取效果的影響。

乙醇質量分數確定：在磷酸氫二鉀質量分數為18 %，加料量為 0.5 g，40 ℃提取 20 min 條件下，考察雙水相體系中不同乙醇質量分數（36%、38%、40%、42%、44%）對洋蔥黃酮提取效果的影響。

磷酸氫二鉀質量分數確定：在乙醇質量分數為40 %，加料量為 0.5 g，40 ℃提取 20 min 條件下，考察雙水相體系中不同磷酸氫二鉀質量分數（16%、18%、20%、22%、24%）對洋蔥黃酮提取效果的影響。

加料量確定：在乙醇質量分數為40%，磷酸氫二鉀質量分數為18%，40 ℃提取20 min 條件下，考察不同洋蔥粉加量（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g）對洋蔥黃酮提取效果的影響。

提取溫度確定：在乙醇質量分數為40%，磷酸氫二鉀質量分數為18 %，加入0.5 g 洋蔥粉，提取時間20 min 條件下，考察不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）對洋蔥黃酮提取效果的影響。

提取時間確定：確定乙醇質量分數為40%，磷酸氫二鉀質量分數為18%，加料量為0.5 g，考察40 ℃下提取不同時間（10、20、30、40、50 min）對洋蔥黃酮提取效果的影響。

1.3.6 乙醇/磷酸氫二鉀體系提取洋蔥黃酮的Box-Behnken 試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇加料量（A）、乙醇質量分數（B）、磷酸氫二鉀質量分數（C）3 個因素作為變量，以洋蔥黃酮提取率（Y）為響應值，設計響應面優化試驗，確定黃酮提取的最佳條件。提取溫度選擇50 ℃，時間選擇30 min。Box-Behnken 試驗設計因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 結果與分析

2.1 槲皮素標準曲線

以不同含量的槲皮素在波長510 nm 處的吸光值A510nm為縱坐標，以槲皮素含量為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 槲皮素標準曲線Fig.1 Standard curve of quercetin

由圖1 可知，在槲皮素含量0～1.2 mg 范圍內，標準曲線線性回歸方程為y=0.478 4x-0.007 2，R2=0.999 5。結果表明，槲皮素含量與吸光值呈良好的線性關系。

2.2 雙水相體系相圖繪制

利用濁點滴定法繪制乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系相圖見圖2。

根據相圖，在兩相區內選擇數據進行洋蔥黃酮提取試驗。

圖2 乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系相圖Fig.2 Phase diagram of EtOH/K2HPO4 aqueous two-phase system

2.3 洋蔥黃酮提取的單因素試驗

2.3.1 乙醇質量分數對洋蔥黃酮提取效果的影響

乙醇質量分數對洋蔥黃酮提取的影響結果見圖3。

圖3 乙醇質量分數對洋蔥黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

乙醇質量分數大小直接影響雙水相體系組成，從而影響黃酮萃取效果。由圖3 可知，在磷酸氫二鉀質量分數一定的情況下，隨著乙醇質量分數的增加，黃酮提取率逐漸增加，在42%時達到最高，當乙醇質量分數繼續增加黃酮提取率顯著降低。其原因是當乙醇濃度較低時不利于黃酮的浸出，隨著體系中乙醇質量分數增加，使上相中乙醇濃度增加，有利于黃酮浸出，同時上相體積逐漸增大[20]，下相體積相對減小，總提取率增大。隨著乙醇質量分數的持續增加，上相的極性減小，一些脂溶性有機物的溶出量也會增加，抑制了總黃酮的浸出。

2.3.2 磷酸氫二鉀質量分數對對洋蔥黃酮提取效果的影響

不同質量分數的磷酸氫二鉀對洋蔥黃酮提取影響結果見圖4。

磷酸氫二鉀質量分數高低對雙水相體系組成有影響，從而影響對洋蔥黃酮萃取效果。由圖4 可見，在乙醇質量分數一定的情況下，隨著磷酸氫二鉀質量分數增加，黃酮提取率先升后降，當磷酸氫二鉀質量分數為22%時提取率最高。這可能是由于當磷酸氫二鉀質量分數增加時，體系中水分的質量分數相應變小，同時鹽對水的爭奪量也增加，上相乙醇濃度相對增加，對黃酮的浸取能力增大，但鹽的增加會導致下相的體積增大，相比減小[21]，過多影響體系整體的萃取能力，從而導致提取率的下降。

2.3.3 加料量對洋蔥黃酮提取效果的影響

加料量對洋蔥黃酮提取效果的影響結果見圖5。

圖4 磷酸氫二鉀質量分數對洋蔥黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ammonium dipotassium hydrogen phosphate mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

圖5 加料量對洋蔥黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of feed quantity on extraction rate of onion flavonoids

由圖5 可知，加料量在0.1 g 時黃酮提取率較低，在0.3 g 時提取率達最高，然后隨著加料量的繼續增加，黃酮提取率逐步降低。其原因可能來自于兩方面的作用，其一是在雙水相體系質量一定情況下，隨著加料量增加溶劑滲透并擴散到細胞內的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，所以提取率下降；其二是干洋蔥粉的加入會吸收雙水相中的部分水分，使乙醇濃度有所提高，所以當加料量特別少時，提取率也較低。上述結果為兩者綜合影響的結果。

2.3.4 提取溫度對洋蔥黃酮提取效果的影響

提取溫度對洋蔥黃酮提取的影響結果見圖6。

圖6 提取溫度對洋蔥黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of onion flavonoids

由圖6 可知，提取溫度為50 ℃時提取率最高，隨著溫度的升高，提取率不斷下降，這是因為乙醇受熱時易揮發，使得雙水相系統萃取能力下降，從而影響提取率。因此優化試驗選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.3.5 提取時間對洋蔥黃酮提取效果的影響

提取時間對洋蔥黃酮的影響結果見圖7。

圖7 提取時間對洋蔥黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of onion flavonoids

由圖7 可見，隨著提取時間的延長，黃酮提取率先升后降，在提取時間為30 min 時達到最大。原因可能是提取初期，洋蔥黃酮隨時間增加不斷浸出，隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出率逐漸達到最大。如果繼續延長時間，乙醇揮發量增加，會引起總黃酮提取效果下降。同時長時間提取還可能造成黃酮類化合物的內部分子結構的破壞[22]，使得黃酮提取率隨之而降低。試驗結果表明，選擇當超聲提取時間為30 min 時，黃酮提取率最高。因此在進行優化試驗時，選取提取時間為30 min。

2.4 Box-Behnken試驗設計與響應面試驗分析

雙水相體系提取洋蔥黃酮的Box-Behnken 試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Minitab 軟件對試驗數據進行分析，所得回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3。

表3 回歸系數顯著性分析Table 3 Significance analysis of regression coefficients

由表3 可知，自變量A、B、C 3 個因素對黃酮提取率的影響大小關系為A＞B＞C，即：加料量＞乙醇質量分數＞磷酸氫二鉀質量分數；其中加料量（A）對結果達到極顯著水平，乙醇質量分數（B）則達到顯著水平；加料量、乙醇質量分數和磷酸氫二鉀質量分數的曲面效應（A2、B2、C2）對結果有極顯著影響；加料量和磷酸氫二鉀質量分數的交互作用（AC）對提取率有顯著影響。各因素回歸擬合后得到回歸方程：Y=5.304 17-0.353 975A-0.137 613B-0.022 762 5C-0.590 758A2-0.786 333B2-1.157 98C2+0.046 875AB+0.196 525AC+0.116 35BC。

模型的方差分析結果見表4。

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

根據表4 回歸模型方差分析結果，模型P＜0.000 1，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬P=0.183＞0.05，表明模型失擬項不顯著；該模型決定系數R2=0.990 6，調整決定系數R2Adj=0.973 8，說明模型擬合度較好，可用該模型預測黃酮在不同工藝條件下的提取率。經過軟件分析可知，3 個因素的極點值對應最優水平分別為：A=-0.313 1，B=-0.107 7，C=-0.042 0，即當加料量為0.24 g、乙醇質量分數為41.78%、磷酸氫二鉀質量分數為21.92%時洋蔥黃酮提取率最高，在最優條件下雙水相萃取洋蔥黃酮，理論最高提取率達到5.367%?？紤]到實際操作及因素對結果影響大小，加料量取0.24 g，將乙醇質量分數調整為41.8 %，磷酸氫二鉀質量分數調整為22 %，在50 ℃下提取30 min，進行3 次平行試驗，該驗證試驗的提取率平均值為5.321 9%，接近預測值，表明本響應面優化設計合理可行，該回歸方程能夠反映各因素與黃酮提取率的影響。

3 結論

本研究利用雙水相萃取法提取洋蔥黃酮，考察了乙醇質量分數、磷酸氫二鉀質量分數、加料量、提取溫度和時間對洋蔥黃酮提取率的影響。通過采用響應面試驗分析優化了洋蔥黃酮的提取條件，得到洋蔥黃酮最佳提取工藝參數為：加料量為0.24 g，乙醇質量分數41.8%，磷酸氫二鉀質量分數22%，提取溫度為50 ℃，提取時間為30 min，此條件下洋蔥黃酮的提取率達5.32%。試驗利用乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系提取洋蔥黃酮具有浸出率高、節約時間、提取效率高、無污染等優點，可為洋蔥黃酮的工業化生產提供理論依據。