響應面法優化藍靛果紅樹莓復合發酵汁的研究

魏文倩，張冰，李利強，劉羽佳，曲敏

（哈爾濱商業大學食品工程學院黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

藍靛果忍冬（Loniceraedulis L.），也叫藍靛果、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等。為忍冬科忍冬屬落葉灌木的小型漿果。在我國東北的大、小興安嶺和長白山地區的野生資源儲量最大[1]。藍靛果中富含花青素、鞣花酸和超氧化物歧化酶等多種抗氧化成分，除此之外還包括 VC、VB1、VB2、VP等多種維生素、膳食纖維、礦物質、幾種人體必需氨基酸等多種營養成分，被稱為“第三代水果”[2-4]。花青素類（anthocyanidins）屬于黃酮醇類化合物，在自然界中廣泛分布，是花色甙（anthocyanins）水解產生的有顏色的甙元[5]。經檢測，藍靛果中原花青素含量為1.9 g/100 g，原花青素是以黃烷-3-醇為結構單元通過C-C 鍵聚合而成的化合物。根據原花青素的聚合程度可分為單倍體（monomer）、寡聚體（oligomer）和多聚體（polymer）。目前，已確定花青素有20 多種，包括天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素等。經研究發現，花青素具有良好的抗氧化性能和顯著的清除自由基的能力，是一種天然、高效的自由基清除劑，具有預防和治療心腦血管疾病、抗腫瘤、抑菌等多種藥用價值[6-8]。

紅樹莓（Rubus ideaus L.），為薔薇科漿果，俗名馬林、覆盆子等，果實甜而多汁、氣味芳香，富含保健藥用活性成分，在世界上享有“黃金水果”的稱號。紅樹莓除了含有糖類、超氧化物歧化酶、氨基酸、有機酸、維生素和礦物質等營養物質外，與藍靛果一樣富含大量的酚類物質，如鞣花酸、花青素、水楊酸等，被譽為“天然阿司匹林”[9-10]，曠慧等[11]通過研究紅樹莓果渣提取物發現紅樹莓中原花青素含量為15.28 mg/g，總黃酮含量為3.71 mg/g。

酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等一些有益菌以新鮮果蔬中的糖類、蛋白質、花色苷等為營養物質，通過代謝而進行發酵，將其轉化為易于人體吸收的小分子營養物質[12]。在此過程中不僅保留了果蔬中原有的營養成分與香氣還會產生新的營養成分，從而使得發酵汁中富含酶類、氨基酸、有機酸、黃酮類等多種營養物質[13-14]。發酵果汁具有很好的自由基清除能力，可以防治自由基引起的疾病，預防、緩解心腦血管疾病，抗衰老等。其中的有益微生物還可促進腸道蠕動，達到通便減肥等功效[15-17]。洪厚勝等[18]以葡萄果渣、糖蜜為原料，利用酵母菌、乳酸菌等多種菌種共同發酵，考察菌種接種量、初始pH 值、糖添加量、超聲時間對超氧化物歧化酶活性及活菌數的影響，獲得最佳工藝條件為初始pH值5.00，糖添加量8 %，活菌接種量12 %，超聲時間60 min，在此最佳工藝條件下超氧化物歧化酶酶活高達660 U/mL。楊志鵬等[19]以海棠果果汁為主要原料，鼠李糖乳桿菌217-3 為發酵菌株，通過氮源添加量、初始pH 值等發酵條件優化，獲得最佳發酵條件為乳清蛋白粉添加量為0.5%，發酵前pH 值為7.0，獲得的發酵汁酸甜可口、抗氧化性強，多酚含量為573 mg/L，膽固醇降解率為73.4%；林冰等[20]以新鮮刺梨為原料，自然發酵，考察糖添加量、發酵溫度及發酵時間對刺梨酵素的影響，獲得刺梨酵素的最佳發酵工藝：糖添加量為20 g，溫度30 ℃，發酵時間5 d，在此最佳工藝條件下獲得的刺梨發酵汁具有較好的清除DPPH 自由基、ABTS 自由基等能力。費鵬等[21]以懷山藥為發酵原料，以植物乳桿菌進行發酵，通過單因素和正交試驗優化得到懷山藥酵素發酵的最佳工藝為糖濃度12%、接種量6%、發酵時間30 h、發酵溫度42 ℃，在該條件下懷山藥發酵汁超氧化物歧化酶活性為15.35 U/mL。莫大美等[22]以玫瑰為發酵原料，以酵母菌和乳酸菌為菌種，考察了接種量和發酵時間，在雙菌種的培養基礎上接種醋酸菌進行聯合發酵，得到具有淡淡的酒香、味道酸甜、具有玫瑰花色的發酵汁。本研究以藍靛果、紅樹莓為原料，采用耐高糖酵母菌為接種菌，以漿果復合發酵汁中原花青素的含量為指標，通過單因素和響應面實驗考察漿果配比、酵母接種量、發酵溫度、發酵時間的影響，確定了最佳發酵工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果凍果和紅樹莓凍果：哈爾濱市郭小果農業科技發展有限公司；安琪耐高糖酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（10 000 u/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；超氧化物歧化酶試劑盒：A001-3 南京信帆生物技術有限公司；乙醇（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：天津市光復科技發展有限公司；DPPH：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KB 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；Z-366 型高速離心機：德國賀默公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計：日本島津公司；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風干燥箱、DHP-9162 型電熱恒溫培養箱、HWS24 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；BS210S 型電子天平：德國Sartorius 儀器公司；HNY-100B 型恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；JYL-C93T 九陽料理機：九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 漿果預處理與酶解

將藍靛果與紅樹莓凍果于室溫20 ℃下解凍，按一定比例分別打漿。將果漿加入到已滅菌的錐形瓶中，按混合果漿的一定比例添加純凈水后，添加2.5%的果膠酶酶解，充分攪拌均勻，室溫20 ℃靜置1 h ～1.5 h。

1.3.2 菌種的活化

將耐高糖酵母菌粉置于37 ℃無菌水中，室溫20 ℃活化 0.5 h～1 h。

1.3.3 藍靛果-紅樹莓復合發酵汁制備的單因素試驗

稱取一定比例的藍靛果和紅樹莓酶解果漿40 g置于無菌錐形瓶中，加入已活化的耐高糖酵母，加入10%的白砂糖，加無菌水定容至100 mL。充分混勻，封口膜封口，在27 ℃恒溫培養箱中發酵。檢測漿果復合發酵汁中原花青素的含量。

1.3.3.1 漿果配比的影響

分別設定藍靛果和紅樹莓果漿比例為0∶1、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，考察藍靛果和紅樹莓原料配比對漿果復合發酵汁中原花青素含量的影響。

1.3.3.2 酵母菌接種量的影響

分別設定酵母接種量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察酵母接種量對漿果復合發酵汁中原花青素含量的影響。

1.3.3.3 發酵溫度的影響

將漿果復合發酵汁分別放置于 22、24、26、28、30 ℃的恒溫箱中進行發酵，考察發酵溫度對漿果復合發酵汁中原花青素含量的影響。

1.3.3.4 發酵時間的影響

將漿果復合發酵汁分別發酵 0、4、8、12、16、20 d，考察發酵時間對漿果復合發酵汁中原花青素含量的影響。

1.3.4 漿果復合發酵汁的響應面實驗

選取漿果配比、酵母接種量、發酵溫度、發酵時間進行四因素三水平的Box-Behnken 中心組合研究，同時運用Design-Expect 8.0.6 軟件對試驗數據進行分析，確定最佳發酵工藝參數見表1。

表1 中心組合試驗因子及編碼值Table 1 Center combination of experimental factor and coding value

1.4 花青素含量的測定

參照李佳橋等[23]的方法進行改進，取50 mL 漿果復合發酵汁樣品，以200 目篩過濾后，于8 000 r/min離心15 min，取上清，得到漿果復合發酵汁工作液。在波長為530 nm 下測漿果復合發酵汁的吸光度。

1.5 漿果復合發酵汁的抗氧化性檢測

1.5.1 超氧陰離子自由基清除率的測定

參照李斌等[24]方法，采用鄰苯三酚自氧化法測定漿果復合發酵汁的超氧陰離子自由基清除率。

1.5.2 DPPH 自由基清除率的測定

參照李杰等[25]的方法并改進，檢測漿果復合發酵汁的DPPH 自由基清除率。取50 mL 漿果復合發酵汁樣品，以200 目篩過濾后，于8 000 r/min 離心15 min，取上清，得到漿果復合發酵汁工作液。向2 mL 漿果復合發酵汁工作液中加入2 mL 0.10 mmol/L 的DPPH 溶液，混勻，25℃避光反應30 min，于517 nm 波長下測定吸光度。按下式計算DPPH 自由基的清除率（%）。

DPPH 自由基清除率/%={1-（Ai-Aj）/A0}×100

式中：A0為DPPH 溶液和蒸餾水混合液的吸光度；Ai為發酵汁工作液和DPPH 混合液的吸光度；Aj為發酵汁工作液的吸光度。

1.5.3 羥基自由基清除率的測定

參照李杰等[25]的方法檢測漿果復合發酵汁對·OH清除作用：取50 mL 漿果復合發酵汁樣品，以200 目篩過濾后，于8 000 r/min 離心15 min，取上清，得到漿果復合發酵汁工作液。將1 mL 鄰菲咯啉（0.75 mmol/L）、3.8 mL 磷酸鹽緩沖液 （0.2 mol/L，pH7.4） 和 1.5 mL Fe2SO（40.75 mmol/L）混勻，后取1 mL 漿果復合發酵汁液和1 mL 0.01%H2O2加入到該混合物中，37 ℃水浴反應60 min，在536 nm 處測吸光值。·OH 清除率通過下式計算：

·OH 清除率/%=（A1－A2）（/A3－A2）×100

式中：A1為樣品的吸光值；A2為不加樣品的吸光值；A3為不加樣品和H2O2的吸光值。

1.6 漿果復合發酵汁酶活力的測定

1.6.1 漿果復合發酵汁超氧化物歧化酶活性的測定

將漿果復合發酵汁進行4 000 r/min 離心10 min后取上清，超氧化物歧化酶活性的測定參照超氧化物歧化酶試劑盒的方法進行測定。

1.6.2 蛋白酶的活力測定

采用GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》，采用福林酚法測定蛋白酶活力；測定漿果復合發酵汁的蛋白酶活力。

2 結果與分析

2.1 漿果比例對漿果復合發酵汁的影響

通過改變藍靛果與紅樹莓的比例考察漿果復合發酵汁中花青素含量的變化見圖1。

從圖1 可以看出，在一定范圍內花青素含量隨藍靛果含量的增加呈現先升高后降低的趨勢，其中藍靛果與紅樹莓的質量比例為3∶1 時花青素含量出現峰值，達到7.4 mg/mL。由于藍靛果和紅樹莓中均富含花青素，原花青素含量分別為1.9 g/100 g 和15.28 mg/g，因為相同質量的藍靛果和紅樹莓，藍靛果中花青素含量更多，所以漿果復合發酵汁中花青素含量隨著藍靛果比例的增大而增加。同時，由于底物濃度的提高，會影響花青素在漿果復合發酵汁中的溶解度，可能會使其溶解度降低。戰偉偉等[26]以藍靛果和椰子研制復合酵素發酵工藝發現，隨著藍靛果添加比例的提高，發酵液中的花色苷和黃酮類物質在復合酵素發酵原液中的溶解度不斷降低，導致其含量的增加趨勢逐漸放緩。這與本研究的結論一致。綜上，確定漿果復合發酵汁中藍靛果和紅樹莓的最適質量比例為3∶1。

圖1 藍靛果與紅樹莓比例對漿果復合發酵汁花青素含量的影響Fig.1 Effect of ratio of Bule Hazelnut and red raspberry on anthocyanin content in berry compound fermented juice

2.2 酵母接種量對漿果復合發酵汁的影響

通過改變酵母接種量考察漿果復合發酵汁中花青素含量的變化見圖2。

圖2 酵母接種量對漿果復合發酵汁花青素含量的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on anthocyanin content in berry compound fermented juice

從圖2 可以看出，隨著酵母接種量的增加，漿果復合發酵汁中花青素的含量呈現先增加后下降的趨勢，當接種量為1.5%時，花青素的含量最高達到8.2 mg/mL。原因是當酵母濃度過低時，酵母生長繁殖速度過慢，發酵液中酵母的數量少，酵母對營養物質的利用率低從而導致發酵速度慢，漿果細胞中花青素溶出過慢，發酵液中花青素含量少。隨著酵母接種量的升高，發酵液中酵母數量增多，由于酵母屬于兼性厭氧菌，代謝過程中會產生乙醇等有機溶劑，使得漿果細胞中的營養物質不斷溶出到發酵液中，從而使得花青素含量升高[27]。但當酵母接種濃度過高時，酵母會過多消耗發酵液中的糖類、蛋白質和維生素等營養物質用于自身過度繁殖，甚至發酵液中營養物質已經不足以用于酵母自身的快速繁殖，從而發酵液中存在大量活著的酵母及其殘體。劉學銘等[27]認為，酵母在繁殖過程中，可能會使花青素的糖苷形式發生降解、產生花青素苷元或發生聚合而成為聚合花青素,均會導致水溶性下降而不斷沉淀下來。本研究發現酵母的表面會吸附花青素，并且花青素會隨著酵母的殘體而沉淀到發酵液底部，且發現酵母的數量越多，發酵液的上清液顏色越淺，可初步判斷酵母對花青素具有較強的吸附能力，從而導致發酵液中花青素含量在一定范圍內隨著酵母接種量的升高而降低，因此酵母接種量過高不利于發酵。綜上，確定漿果復合發酵汁的酵母接種量為1.5%。

2.3 溫度對漿果復合發酵汁的影響

通過改變發酵溫度考察漿果復合發酵汁中花青素含量的變化見圖3。

圖3 溫度對漿果復合發酵汁花青素含量的影響Fig.3 Effect of temperature on anthocyanin content in berry complex fermented juice

從圖3 可以看出，隨著發酵溫度的升高，漿果復合發酵汁中花青素的含量呈現先增加后下降的趨勢，當溫度為28 ℃時，花青素的含量最高達到7.9 mg/mL。原因可能溫度過低，酵母的生長繁殖速度慢，數量少，進而對營養物質的利用率低、發酵速度慢，且溫度過低時藍靛果和紅樹莓細胞中花青素溶出過慢、溶解度低，導致發酵液中花青素含量少。而隨著溫度的升高，酵母的繁殖速度加快，在其代謝過程中由于兼性厭氧菌的特性會產生乙醇等有機溶劑，從而促使漿果細胞中的花青素等不斷溶出，花青素含量升高。但當溫度過高時，酵母繁殖和衰老速度過快，大量酵母的表面對花青素的吸附又導致花青素會隨著酵母的殘體而沉淀到發酵液底部。同時花青素的不穩定性使其在溫度過高時易分解，導致花青素含量在一定范圍內隨著發酵溫度的升高而降低。因此，發酵溫度應控制在適宜的范圍內[28]。綜上，確定漿果復合發酵汁的最適發酵溫度為28 ℃。

2.4 發酵時間對漿果復合發酵汁的影響

通過改變發酵時間考察漿果復合發酵汁中花青素含量的變化見圖4。

圖4 發酵時間對漿果復合發酵汁花青素含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on anthocyanin content in berry compound fermented juice

從圖4 可以看出，隨著發酵時間的延長，漿果復合發酵汁中花青素的含量呈現先升高后下降的趨勢，當發酵在第8 天時，花青素的含量最高達到7.8 mg/mL。可能是隨著發酵時間的延長，在果膠酶的緩慢作用下漿果細胞中花青素逐漸溶出，同時酵母代謝中產生的乙醇等有機溶劑又促進了花青素的溶出[29-30]。本研究中，在二者的疊加作用下，加劇了花青素的溶出。但由于花青素分子結構的特殊性，受發酵體系中pH 值、殘糖量、酒精度等環境因素的影響較大，因此隨著發酵時間的延長，花青素的形態發生一系列變化甚至降解，加上酵母對色素的吸附以及微生物產酶促作用都可能造成前花青素含量下降[30]。本研究中通過觀察發酵液的顏色深淺可以得出，隨著發酵時間的延長，發酵液的上清液顏色越淺，佐證了花青素的含量逐漸降低。綜上，酵素的適宜發酵時間確定為8 d。

2.5 響應面法優化工藝條件結果分析

2.5.1 工藝參數優化

中心試驗設計及試驗結果見表2。

經過Design-Expect 8.0.6 軟件對數據的回歸分析，以花青素含量Y 為響應值，得到花青素含量預測值對編碼自變量的回歸方程為：

花青素含量：Y=8.72+0.62×A-0.25×B+0.071×C+0.064×D+0.26×A×B+0.34×A×C-0.12×A×D-0.18×B×C-0.22×B×D-0.21×C×D-1.15×A2-0.24×B2-0.98×C2-1.19×D2

回歸模型的方差分析見表3。

表2 中心試驗設計及試驗結果Table 2 Center experimental design and experimental results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression models

續表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression models

分析表3 可知，因素變量的大部分一次項和二次項對漿果復合發酵汁中花青素含量的影響是高度顯著的（P＜0.000 1），部分二次交互項對響應值影響不顯著（P＞0.05）。該模型的Adj R2=0.971 2，說明模型能解釋97.12%響應值的變化，模型的P 值為＜0.000 1，說明模型的回歸極其顯著，擬合較好；從回歸分析表中得出：A、B、C、D 4 個因素對花青素含量的影響為：藍靛果與紅樹莓比例（A）＞酵母菌接種量（B）＞發酵溫度（C）＞發酵時間（D）。

2.5.2 漿果復合發酵汁影響因素響應面分析與驗證

響應面圖形是響應值對各試驗因素所構成的三維空間曲面圖見圖5，從響應面分析圖上可以找出最佳工藝參數及各工藝參數之間的相互作用。響應面圖可以更清晰地反映因素對響應值的影響。

圖5 各因素交互作用對漿果發酵汁中花青素含量的影響響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the effects of various factors on the anthocyanin content in berry compound fermented juice

由圖5 可知，響應面均為開口向下，隨著每個變量因素的增大，響應值增大，響應值增大到極值后，隨著變量因素的增大，響應值減小。響應曲面越陡，說明響應因素對響應值的影響越顯著。模型頂點為最佳工藝參數。經Design-Expect8.0.6 軟件分析得到最佳發酵工藝條件為溫度 28.23 ℃，藍靛果∶紅樹莓=3.23∶1（質量比），酵母接種量為1.27%，發酵時間為8.19 d，在此條件下，漿果復合發酵汁的花青素理論含量為8.854 mg/mL。根據實際操作條件對經Design-Expect 8.0.6 軟件分析得到的最佳工藝條件進行調整，確定最后驗證試驗的發酵工藝條件為：溫度 28 ℃，藍靛果∶紅樹莓=3.23∶1（質量比），酵母接種量為1.27%，發酵時間為8 d。

經過3 次重復試驗驗證，得到復合發酵汁花青素含量為8.91 mg/mL，與預測值相近，說明優化工藝重復性良好，最優工藝的結果可靠，在此工藝條件下，較初始鮮漿果復合果汁提高了71.35%。

2.6 漿果復合發酵汁抗氧化能力和酶活力檢測

檢測漿果復合發酵汁的抗氧化能力與酶活力，結果見表4。

表4 漿果復合發酵汁的抗氧化能力與酶活力檢測結果Table 4 Antioxidant ability and enzyme activity test results of composite fermented juice

由表4 結果可知，漿果復合發酵汁具有良好的抗氧化能力，具有一定的蛋白酶活性和超氧化物歧化酶酶活性。

3 結論

通過單因素試驗和響應面法分析確定漿果復合發酵汁的最佳發酵工藝條件為：藍靛果∶紅樹莓的比例為3.23∶1，酵母接種量為 1.27%，發酵溫度為 28 ℃，發酵時間為8 d。在此最佳工藝條件下測得漿果復合發酵汁花青素含量最高，達8.91 mg/mL，較初始鮮漿果復合果汁提高了71.35%。

DPPH 自由基清除率為（97.41±0.4）%，·OH 清除率為（95.56±0.4）%，O2-·清除率為（98.21±0.4）%，說明發酵汁的抗氧化能力很強。蛋白酶活力為（9.42±0.2）U/mL，超氧化物歧化酶活力為（82.45±0.4）U/mL。

藍靛果紅樹莓復合發酵汁呈深紫色，清澈，具有紅樹莓特有的清爽香氣，口感略澀有醇厚感。