三結(jié)構(gòu)域蛋白14在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

倪晨明 鄭楷煉 潘亞奇 倪燦榮 金鋼

1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胰腺外科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科，上海 200433

胰腺癌為早期癥狀隱匿、療效不佳、預(yù)后極差的高度惡性腫瘤，我國胰腺癌患者約占惡性腫瘤病例數(shù)的2.42%，且發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[1]，因此深入研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，有助于胰腺癌早期診斷、延緩腫瘤發(fā)展和為治療提供精準(zhǔn)化靶點(diǎn)。三結(jié)構(gòu)域蛋白 14(tripartite motif 14，TRIM14)與腫瘤的生物學(xué)行為和臨床病理特征之間存在密切的關(guān)系，在腫瘤的血管生成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡抵抗中起到關(guān)鍵作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)TRIM14可顯著激活NF-κB信號通路[4-5]，而NF-κB信號通路為胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵核心途徑[6]。目前TRIM4在胰腺癌中的表達(dá)意義尚不明確，其表達(dá)與NF-κB信號通路活化關(guān)系也不清楚。本研究通過檢測胰腺癌組織TRIM14、磷酸化p65(phosphorylation p65, P-p65)及NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表達(dá)，分析TRIM14與NF-κB的關(guān)系，探討TRIM14在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

資料與方法

一、臨床資料及組織標(biāo)本

收集2016年1月至2018年12月間海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胰腺外科176例行手術(shù)切除且病理確診的胰腺癌患者癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織(距離病灶3 cm處的正常胰腺組織)標(biāo)本。其中男性95例，女性81例，年齡42～73歲，平均63歲。參考美國國立綜合癌癥網(wǎng)2011年中文版胰腺癌指南中TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期41例、Ⅱ期83例、Ⅲ期52例；根據(jù)病理分級，低分化46例、中分化79例、高分化51例。納入患者術(shù)前均無放療、化療、生物治療等治療史，患者及家屬均簽署知情同意書。術(shù)后通過定期門診復(fù)診或電話隨訪獲取病例的復(fù)發(fā)時間及總生存時間，隨訪時間截至2019年5月。176例胰腺癌及對應(yīng)癌旁組織經(jīng)手術(shù)切除后，置于4%甲醛溶液固定并石蠟包埋備用，其中12例手術(shù)切除后迅速放入液氮凍存。

二、胰腺癌及對應(yīng)癌旁組織TRIM14蛋白表達(dá)檢測

組織石蠟標(biāo)本制作成4 μm切片，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測組織TRIM14蛋白表達(dá)，按試劑盒說明書操作。兔抗人TRIM14多克隆抗體購于英國abcam公司，工作濃度1∶1 000；多聚物抗兔、鼠IgG-HRP二抗購于北京中杉金橋公司，工作濃度1∶5 000，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以已知陽性的人肝組織為陽性對照，用PBS代替一抗為陰性對照，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。由兩位病理科醫(yī)師分別鏡下閱片，針對TRIM14染色強(qiáng)度及范圍進(jìn)行評分[5]。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色范圍評分：<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分的乘積為總評分，1～3分為弱陽性，4～7分為中度陽性組，8分及以上為強(qiáng)陽性[7]。

三、胰腺癌組織TRIM14、P-p65蛋白表達(dá)檢測

取液氮凍存胰腺癌組織50 mg，碾磨成粉末狀，使用RIPA裂解液裂解組織，抽提總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測TRIM14、P-p65表達(dá)水平。小鼠抗人P-p65、小鼠抗人p65及小鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Cell Signal公司，工作濃度為1∶1 000，TRIM14一抗、二抗及其工作濃度同上。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。應(yīng)用Bio-Rad 公司的全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，以目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

四、胰腺癌組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達(dá)檢測

取液氮凍存胰腺癌組織，解凍后采用Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度儀法測定RNA純度及濃度。先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。再用熒光定量PCR法檢測組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達(dá)，熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司。Bcl-xl正向引物為5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，反向引物為5′-TCCATCTCCGATTCGTCCCT-3′；CCND1正向引物為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，反向引物為5′-CCCCTTCGCACACATTTGAA-3′；VEGF-C正向引物為5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物為5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′。以β-actin作為內(nèi)參。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃ 5 min。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，按公式2-△△Ct計算目的基因mRNA表達(dá)量。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌組織TRIM14蛋白表達(dá)

TRIM14蛋白主要定位于胞質(zhì)中(圖1)。176例癌組織中TRIM14蛋白表達(dá)陰性23例(13.1%)，弱陽性39例(22.2%)，中度陽性73例(41.4%)，強(qiáng)陽性41例(23.3%)；癌旁組織分別為128例(72.7%)、26例(14.8%)、17例(9.7%)、5例(2.8%)。胰腺癌組織TRIM14蛋白表達(dá)總陽性率為86.9%，顯著高于癌旁組織的27.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=127.846，P=0.000)。

二、胰腺癌組織TRIM14表達(dá)水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

將TRIM14陰性和弱陽性表達(dá)患者歸為低表達(dá)組，中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)患者歸為高表達(dá)組。結(jié)果顯示，胰腺癌組織TRIM14表達(dá)水平與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度均呈顯著相關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(表1)。

注：TRIM14為三結(jié)構(gòu)域蛋白14圖1 胰腺癌(1A)及癌旁組織(1B)TRIM14蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 × 200)

表1胰腺癌組織TRIM14表達(dá)水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

臨床病理參數(shù)TRIM14蛋白表達(dá)低表達(dá)組(62例)高表達(dá)組(114例)χ2值P值性別 男35600.2360.372 女2754年齡(歲) ≤6529362.1240.998 >653366分化程度 高17340.1420.931 中2851 低1729臨床分期 Ⅰ期291235.7040.000 Ⅱ期2756 Ⅲ期646浸潤深度 T1201865.7600.000 T21720 T31532 T41044遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無53940.2680.386 有920淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無30364.8410.021 有3278

注：TRIM14為三結(jié)構(gòu)域蛋白14

三、胰腺癌組織TRIM14表達(dá)水平與患者預(yù)后間的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TRIM14表達(dá)水平，影響總生存期的因素包括腫瘤分化程度、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TRIM14表達(dá)水平(P值均<0.05，表2)。多因素分析結(jié)果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度和TRIM14表達(dá)水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TRIM14表達(dá)水平(表2)。由此可見，TRIM14蛋白高表達(dá)是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨(dú)立危險因素。

四、TRIM14表達(dá)水平與NF-κB信號通路活化的關(guān)系

12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達(dá)水平見表3。胰腺癌組織TRIM14與P-p65表達(dá)的變化趨勢較為一致(r=0.86，P<0.01，圖2A)，即高表達(dá)TRIM14的胰腺癌組織的p65磷酸化程度也較高，提示NF-κB激活。胰腺癌組織NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達(dá)水平也與TRIM14表達(dá)有較高的一致性(r值分別為0.85、0.91、0.92，P值均<0.01，圖2B)，進(jìn)一步表明TRIM14高表達(dá)與癌細(xì)胞NF-κB激活有明顯關(guān)系。

討 論

近年來研究報道指出，TRIM家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。TRIM14基因為其家族成員之一，定位在人的9q22號染色體上，蛋白結(jié)構(gòu)包括1個卷曲螺旋域、1個B-box結(jié)構(gòu)域和1個C端PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。Zhuang等[8]研究指出TRIM14過表達(dá)可加速細(xì)胞周期，通過PI3K/AKT信號通路影響細(xì)胞的有絲分裂過程。杜天明等[9]研究發(fā)現(xiàn)TRIM14在胃癌組織高表達(dá)，可能參與胃癌惡化的過程。白明輝等[10]發(fā)現(xiàn)TRIM14在胰腺癌組織中也高表達(dá)，且與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及癌細(xì)胞侵襲能力之間有著密切關(guān)系，TRIM14表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，TRIM14在胰腺癌組織高表達(dá)，與上述報道基本相符。進(jìn)一步分析TRIM14表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，TRIM14表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性病理特征顯著相關(guān)，提示 TRIM14可能參與了胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控。Cox回歸分析結(jié)果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤的分化程度和TRIM14的表達(dá)水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TRIM14的表達(dá)水平，可見TRIM14高表達(dá)是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨(dú)立危險因素。

表2 與胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期相關(guān)風(fēng)險因素的分析

注：TRIM14為三結(jié)構(gòu)域蛋白14

表3 12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA的表達(dá)水平

注：TRIM14為三結(jié)構(gòu)域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細(xì)胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內(nèi)皮生長因子-C

注：TRIM14為三結(jié)構(gòu)域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細(xì)胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內(nèi)皮生長因子-C

圖212例胰腺癌組織TRIM14表達(dá)水平與P-p65/p65比值(2A)及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達(dá)水平(2B)的相關(guān)性

TRIM14在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制報道較少， Su等[4]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TRIM14可通過激活NF-κB信號通路增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIM14表達(dá)水平與NF-κB信號通路激活狀態(tài)呈正相關(guān)，提示TRIM14可能通過活化NF-κB信號通路促進(jìn)癌癥發(fā)生。進(jìn)一步的調(diào)控機(jī)制尚需在體外細(xì)胞實驗中得到驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突