腱糖蛋白C在膿毒癥小鼠模型及細胞模型中的表達

顧潔 殷江文 張夢潔 繆紅軍 李軍

膿毒癥是指機體對感染的反應失調而引起的、危及生命的多器官功能障礙，進一步發展可引起全身各器官功能衰竭及休克[1]。該病發生率逐年上升，病情兇險，病死率高[2]。目前尚無治療嚴重膿毒癥及膿毒癥休克的特效藥物。因此，早期診斷與治療是關鍵。關于膿毒癥新診斷標志物的探索，一直是研究的熱點[3]。腱糖蛋白C（tenascin-C，TNC）是一種細胞外基質糖蛋白，是腱糖蛋白家族的重要一員。它參與多種生物胚胎發育過程，同時參與炎癥、組織損傷、腫瘤血管生成和轉移等病理過程[4]。感染和損傷可誘導TNC表達，從而促進機體產生對細菌脂多糖（LPS）的免疫應答效果。TNC能使巨噬細胞在LPS激活Toll樣受體4（TLR4）時，促進促炎細胞因子的翻譯并抑制抗炎細胞因子的合成，在介導TLR4信號途徑調節炎癥表達中起關鍵作用[5]。TNC的表達可能與膿毒癥發生、發展過程中的炎癥反應存在相關性。因此，本研究觀察了膿毒癥小鼠多種重要臟器組織及RAW264.7單核巨噬細胞經LPS處理后不同時點TNC表達情況，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物分組和建模 將30只SPF級、6～8周齡、體重18～20g的C57BL/6小鼠（南京醫科大學動物實驗中心）按隨機數字表法分成2組，即對照組（Sham組）和盲腸結扎穿孔組[6]（CLP組），每組15只。膿毒癥CLP建模：術前6h禁食、3h禁飲，腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）麻醉后，沿腹正中線作1cm左右的縱向切口，暴露腹腔分離并找到盲腸，將盲腸結扎穿刺，擠出少許腸內容物，然后將盲腸回納后關閉腹腔，皮下注射37℃的0.9%氯化鈉溶液后復蘇。術后24h頸椎脫臼法處死小鼠，取重要臟器組織作相應檢測。

1.2 小鼠肺組織病理檢查 （1）HE染色：取小鼠肺組織，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色切片，在顯微鏡下觀察拍照。（2）免疫組化染色：將剩余石蠟塊脫蠟、脫水，行免疫組化染色，棕黃色為TNC陽性表達，在光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織TNC陽性表達情況。同時計算陽性累計光密度值（IOD），即TNC陽性表達水平。

1.3 小鼠血清TNC水平檢測 采用酶聯免疫吸附法。從小鼠心臟大血管中取血，3 000g離心15min留取血清；嚴格按照試劑盒（購于武漢EIAab公司）說明書進行操作，雙抗體夾心法檢測血清TNC水平，所有樣品設復孔，并在同一批次內完成。

1.4 小鼠肝、心、肺、腎組織TNC mRNA表達檢測 采用反轉錄聚合酶鏈反應法。取小鼠肝、心、肺、腎組織樣本各稱取30mg，加入Trizol試劑500μl，充分勻漿，使組織充分裂解；加入 Trizol試劑 500μl和氯仿 200μl，震蕩混勻至粉紅色，靜置5min，4℃ 12 000g離心15min，轉移上清液至新的無酶EP管；加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫下靜置10min，4℃ 12 000g離心10min，棄上清液；加入預冷的75%無水乙醇1ml洗滌沉淀，4℃ 7 500g離心5min，棄上清液，干燥；根據沉淀量的多少加入DEPC水20～30μl，4℃冰箱過夜充分溶解。使用One Drop分光光度計測定RNA樣品OD260/OD280比值及濃度，均在1.80～2.00則表示RNA純度較高。使用HiSCRiptⅡQ RT SuperMix配置逆轉錄體系將RNA逆轉錄為cDNA。按照SYBR qPCR Master Mix配置反應體系，預變性 95℃ 30s，循環反應 95℃ 10s，60℃ 30s，40 個循環；熔解曲線 95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。根據 CT 值分析，使用內參基因GAPDH計算TNC mRNA相對表達量。根據文獻設計小鼠TNC和GAPDH引物（由南京一道生物科技有限公司合成），見表1。

表1 小鼠TNC基因及內參引物序列

1.5 體外細胞培養及處理 將小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7（購于美國ATCC公司）接種在含10%胎牛血清+青霉素100U/ml+鏈霉素100μg/ml的DMEM培養基中，置于含5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞生長至70%～80%后進行傳代，2～3d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。本實驗分為2組，即空白對照組（Con組）、LPS組。RAW264.7細胞培養在6孔板中，每孔2ml，加入濃度100ng/ml的 LPS 進行處理；分別在 0、2、4、8、12、24h 收集細胞及上清液，同時Trizol試劑提取總RNA，以備檢測。

1.5.1 細胞上清液腫瘤壞死因子α（TNF-α）及TNC水平檢測 采用酶聯免疫吸附法，具體方法同1.3。

1.5.2 細胞中TNC mRNA表達檢測 采用反轉錄聚合酶鏈反應法，具體方法同1.4。

1.6 統計學處理 應用SPSS 21.0、Graphpad Prime 7.0統計軟件。樣品平行重復檢測3次取平均值，計量資料用表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用重復測量數據的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠一般情況比較 Sham組小鼠術后一般情況尚可，可正常活動，無死亡；CLP組小鼠術后精神萎靡，心率、呼吸增快，可見口唇發紺，術后12h出現第1只小鼠死亡，18h后死亡只數增加，至24h處死時共死亡5只；它們死前均有體溫下降、口唇發紺，破腹后可見腹腔有渾濁滲出液、腸道粘連、盲腸壞死，考慮死因為感染性休克。

2.2 兩組小鼠肺組織HE染色及免疫組化染色比較HE染色見CLP組小鼠肺組織損傷較Sham組嚴重，肺泡明顯擴張、塌陷，炎癥細胞大量浸潤，進一步說明造模成功，見圖1（插頁）。免疫組化染色見CLP組小鼠肺組織TNC陽性表達，棕黃色染色明顯沉積于肺泡毛細血管內，且多分布在肺泡隔中大量浸潤的炎癥細胞周圍；而對照組小鼠肺組織中僅少量表達，見圖2（插頁）。CLP組肺組織TNC表達水平為3 231±518，明顯高于Sham組的 1 429±328.2，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠肺組織HE染色所見（a：CLP組；b：Sham組；×10）

圖2 兩組小鼠肺組織抗TNC免疫組化染色所見（a：CLP組；b：Sham 組；×20）

2.3 兩組小鼠血清TNC水平及重要臟器組織TNC mRNA表達比較 CLP組小鼠血清TNC水平為（15.74±0.45）ng/ml，明顯高于 Sham 組的（8.0±0.51）ng/ml，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Sham組比較，CLP組小鼠心、肺、腎組織TNC mRNA相對表達量均明顯增高，肝組織TNC mRNA相對表達量明顯減少，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 2。

表2 兩組小鼠重要臟器組織TNC mRNA相對表達量比較

2.4 LPS對細胞上清液TNF-α、TNC水平及細胞中TNC mRNA表達的影響 Con組幾乎不表達TNF-α，而LPS組細胞上清液TNF-α濃度明顯升高，提示LPS成功誘導小鼠膿毒癥細胞模型。100ng/ml的LPS處理RAW264.7細胞后，各時點細胞上清液TNC水平及細胞中mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；呈一定的時間依賴，8h達峰值，見表3。

3 討論

常見的小鼠膿毒癥模型有CLP宿主屏障破壞模型、尾靜脈注射LPS的膿毒血癥模型和腹腔注射活病原體的細菌感染模型。而本實驗選擇CLP造模，能相對模擬機體炎癥、血流動力學及免疫反應等過程[7]。實驗組前期發現CLP術后6h小鼠開始出現癥狀，24h炎癥反應最明顯[8]，因此本實驗選擇術后24h留取標本。巨噬細胞的異常活化在膿毒癥、膿毒癥休克以及其導致的多器官功能衰竭等病理過程中起著關鍵作用。細菌的LPS大部分通過與TLR4結合介導的髓樣分化因子88途徑，使巨噬細胞活化，進而發生炎癥級聯失控瀑布效應[9]。因此，本實驗還選擇了同源性的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，觀察經LPS處理后不同時點TNC表達情況。本實驗結果發現，TNC的表達呈一定的組織及時間特異性。CLP小鼠血清TNC水平較Sham組明顯增加，重要臟器組織TNC mRNA表達較Sham組也有差異，其中心、肺、腎組織TNC表達明顯增加，肝組織TNC表達減少。小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7在LPS刺激后，細胞中TNC mRNA表達明顯增加，隨著時間推移不斷增高，呈一定的時間依賴。

TNC是一種大分子基質蛋白，具有促進細胞遷移、細胞黏附、前炎癥因子合成及血管重塑等作用。它在正常人體組織中極少表達或不表達，當組織損傷后表達增高。TNC在腫瘤組織中高表達，因此是目前腫瘤疾病研究的熱點。Yuan等[10]對167例ICU膿毒癥患者24h血TNC水平進行檢測，同時觀察了30d死亡情況，結果發現TNC水平較高的58例患者在30d內死亡；可見，膿毒癥患者TNC水平升高與預后差有關。Uddin等[11]使用100ng/ml的LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7，結果發現在處理8h后細胞上清液TNC水平及mRNA表達最高，與本實驗結果一致；同時發現一氧化碳釋放分子2（CORM-2）可明顯降低LPS誘導的TNC、促炎細胞因子表達，同時增加白細胞介素10表達；還發現TNC siRNA轉染細胞能顯著抑制LPS刺激細胞產生細胞因子，CORM-2調節白細胞介素10表達并在體內外抑制TNC介導的炎癥表達。

綜上所述，在膿毒癥炎癥發展過程中，TNC呈現一定的組織及時間特異性，可作為早期診斷膿毒癥的潛在生物標志物。

表3 LPS對細胞上清液TNF-α、TNC水平及細胞中TNC mRNA表達的影響