綠原酸對顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放的影響及作用機制研究

陳昕婷 林微微 陳建治

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是一類臨床癥狀表現(xiàn)為顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、異常關(guān)節(jié)音或伴有下頜運動障礙的疾病的總稱，人群中發(fā)病率為20%～40%，是口腔科常見病、多發(fā)病之一[1]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的一種重要類型，是一類主要累及顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨、滑膜及軟骨下骨的以關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨骨質(zhì)改變?yōu)橹饕卣鞯钠髻|(zhì)性病變[2]。研究顯示，顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥因子釋放和軟骨基質(zhì)減少密切相關(guān)[3]。綠原酸又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸和奎尼酸形成的縮酚酸，為極性有機酸。綠原酸的生物活性廣泛，隨著研究的深入，許多新的藥效被陸續(xù)挖掘，包括抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等[4-5]。綠原酸能夠通過抑制NLRP3炎性復(fù)合體/核因子κB（NF-κB）通路發(fā)揮對關(guān)節(jié)炎的治療作用[6]，但其作用機制尚不完全明了。基于此，本研究采用不同濃度綠原酸干預(yù)白細(xì)胞介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷，分析綠原酸對軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放的影響，以探討綠原酸對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的保護作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 取6周齡雄性SD大鼠購自上海斯萊克公司，體重140～160g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心在25℃，空氣濕度65%的環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法[7]獲取原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，具體方法為戊巴比妥鈉麻醉下處死SD大鼠，75%乙醇消毒10min，在超凈臺中切取顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨，剪成小塊并碾磨，在37℃胰蛋白酶溶液中培養(yǎng)2h；倒掉胰蛋白酶消化液，使用磷酸鹽緩沖液沖洗，然后在37℃的0.2%膠原酶溶液中培養(yǎng)過夜；消化后以800r/min離心15min收集原代顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑 含量≥98%的綠原酸購自杭州諾揚生物技術(shù)有限公司；重組人IL-1β購自上海生工生物科技有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；TRIzol購自美國Promega公司；RNA擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物購自上海生工生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDHL均購自美國Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀（0900544s型）購自德國Eppendorf公司；恒溫振蕩器（THZ-C-1型）購自蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；臺式冷凍離心機（5804R型）購自德國Eppendorf公司；離心濃縮儀（TDZ4-WS型）購自長沙湘智離心機儀器有限公司；低溫超速離心機（CT15RE型）購自日本Himac公司；低溫儲存箱系列（HYC-360型）購自中國Haier公司；超低溫冰箱（MDF-U54V型）購自日本Panasonic公司；光學(xué)顯微鏡（SOIF、XSP-ZCA型）購自上海光學(xué)儀器工廠；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z型）購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；蛋白電泳儀（Powerpmac 043BR80551型）購自美國BIO-RAD公司；高速離心機（5424型）購自德國Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中于37℃、5%二氧化碳條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將軟骨細(xì)胞分為模型組、實驗組、對照組。模型組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，實驗組細(xì)胞采用含10ng/ml IL-1β和不同濃度綠原酸（10、20、40、80 和 160μmol/L）的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，對照組細(xì)胞進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗 采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，不同組的細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔，在37℃、5%二氧化碳條件下分別培養(yǎng)24、48h，每孔加入10μl的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后于酶標(biāo)儀中測定細(xì)胞在450nm的OD值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實驗 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞，不同組的細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種到12孔板中，胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)48 h后細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后制備成細(xì)胞懸液，然后加入10μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶 3（MMP-3）、MMP-13、Wnt-5A 和 Ror2 mRNA 表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，通過紫外分光光度儀測定OD260/OD280值，取用OD260/OD280值在1.8～2.0的樣本。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用RNA擴增試劑盒通過實時定量PCR擴增cDNA。以GAPDH為靶基因內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達(dá)水平。

1.2.5 Wnt-5A和Ror2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。不同組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白，然后用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔加入50μg的待測蛋白于SDS-PAGE凝膠，110V電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1h，分別加入兔抗人Wnt-5A、Ror2和GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜 3×10min，二抗 37℃ 孵育1 h，TBST洗膜3×30min，ECL顯影。運用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作內(nèi)參，計算相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對細(xì)胞增殖的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后，模型組、實驗組細(xì)胞在24h和48h的增殖能力均較對照組明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。在培養(yǎng)24h后，40μmol/L實驗組較模型組細(xì)胞增殖能力增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1a。在培養(yǎng)48h后，20、40和80μmol/L實驗組較模型組細(xì)胞增殖能力均增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1b。因此在后續(xù)實驗中選用20、40和80μmol/L的綠原酸對軟骨細(xì)胞干預(yù)48h。

2.2 綠原酸對細(xì)胞凋亡的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后，模型組、實驗組細(xì)胞凋亡率較對照組均明顯升高，但實驗組細(xì)胞凋亡率低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），即 20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖1 綠原酸對細(xì)胞增殖的影響（a：培養(yǎng)24h的增殖能力比較；b：培養(yǎng)48h的增殖能力比較）

圖2 綠原酸對細(xì)胞凋亡的影響（a：對照組細(xì)胞流式圖；b：模型組細(xì)胞流式圖；c：20μmol/L實驗組細(xì)胞流式圖；d：40μmol/L實驗組細(xì)胞流式圖；e：80μmol/L實驗組細(xì)胞流式圖；f：不同組軟骨細(xì)胞凋亡率比較）

2.3 綠原酸對細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷后，模型組、實驗組細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均較對照組明顯升高，MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)水平亦均較對照組明顯升高，但實驗組細(xì)胞TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。即20、40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平，40和80μmol/L綠原酸均能明顯抑制軟骨細(xì)胞IL-6、MMP-3mRNA表達(dá)水平（均P＜0.05）。40μmol/L實驗組軟骨細(xì)胞較模型組MMP-13的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 綠原酸對細(xì)胞炎癥因子釋放的影響（a：TNF-α mRNA的表達(dá)水平比較；b：IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較；c：MMP-3 mRNA的表達(dá)水平比較；d：MMP-13 mRNA的表達(dá)水平比較）

2.4 綠原酸對細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號通路的影響 采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后，模型組、實驗組細(xì)胞中Wnt-5A、Ror2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。20、40和80μmol/L實驗組細(xì)胞 Wnt-5A、Ror2 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 4。

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷為主要特征，伴有滑膜及軟骨下骨組織改變的關(guān)節(jié)退行性疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增多趨勢，容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的口腔功能和生活質(zhì)量[8]。目前對顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的常規(guī)治療效果不理想，治療方法多以保守治療為主，包括服用非甾體類抗生素、局部理療、關(guān)節(jié)腔注射藥物等[9]。目前采用中藥治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的研究尚少。

IL-1是一種重要的炎癥因子，由IL-1α與IL-1β兩種蛋白質(zhì)組成，可與IL-1受體結(jié)合，從而激活下游炎癥通路。其作為炎癥的始動因子，在軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中起到關(guān)鍵作用[10]。IL-1β可能通過刺激TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的分泌和抑制膠原蛋白、組織金屬蛋白酶抑制因子等的合成來干擾關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝，顯著抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，使軟骨細(xì)胞變性及細(xì)胞外基質(zhì)降解，引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和破壞，是造成顳下頜關(guān)節(jié)器質(zhì)性損害的一種重要炎癥介質(zhì)[11]。本研究采用IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示IL-1β能夠明顯抑制軟骨細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放。這提示本研究IL-1β誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷造模成功。

研究顯示，綠原酸可以降低關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和MMP-3含量以及MMP-3酶活性，對關(guān)節(jié)軟骨損傷具有一定的保護作用[12]。綠原酸可以提高內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位、上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Caspase，降低細(xì)胞凋亡率，對內(nèi)皮細(xì)胞起保護作用[13]。同時綠原酸能夠抑制軟骨樣細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，穩(wěn)定細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來保護線粒體膜電位，促進凋亡抑制基因Bcl-2和抑制半胱氨酸蛋白酶表達(dá)有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示不同濃度綠原酸干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷后，綠原酸能夠促進軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，抑制 TNF-α、IL-6、MMP-3 和 MMP-13 的表達(dá)水平。這提示綠原酸在顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中具有促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放的作用。

圖4 綠原酸對細(xì)胞Wnt-5A/Ror2信號通路的影響（a：Wnt-5A mRNA的表達(dá)水平比較；b：Ror2 mRNA的表達(dá)水平比較；c：Wnt-5A蛋白的表達(dá)水平；d：Ror2蛋白的表達(dá)水平；e：Wnt-5A和Ror2蛋白電泳圖）

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅依賴性的對細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝起催化作用的蛋白水解酶，能降解幾乎所有的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用[15]。成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶以無活性酶原形式出胞，無活性酶原能被多種炎癥因子激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示，綠原酸能夠明顯抑制MMP-3和MMP-13的表達(dá)，這提示綠原酸能夠抑制顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

Wnt信號通路與軟骨細(xì)胞的分化發(fā)育密切相關(guān)，是較早發(fā)現(xiàn)的與顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)的信號通路之一[17]。研究發(fā)現(xiàn)Wnt-5A/Ror2信號通路激活可以上調(diào)軟骨細(xì)胞 MMP-1、MMP-3、MMP-9和 MMP-13的表達(dá)，從而參與骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞過程[18]。Wnt-5A可以促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，通過下調(diào)Runx2、Cxcl12的表達(dá)和Rankl/Opg比例，進而抑制細(xì)胞的成骨分化[19]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的綠原酸均能夠降低Wnt-5A、Ror2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，提示綠原酸能抑制IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt-5A/Ror2信號通路的激活，進而抑制軟骨細(xì)胞的損傷。

綜上所述，綠原酸或通過抑制Wnt-5A/Ror2信號通路調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子釋放。綠原酸或可作為治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的藥物。