三葉青提取物對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響及作用機制研究

黃慧偉 杜蔚連 鄧茜

宮頸癌作為婦科常見腫瘤之一，近年來發病率已經排在女性惡性腫瘤第2位[1]。由于腫瘤放療、化療帶來的毒副反應較強，從天然植物中篩選抗腫瘤藥物已成為熱門研究方向。三葉青主要產于我國浙江、福建、江蘇等少數地區，現有研究發現其能有效治療肝炎、緩解風濕性關節炎癥狀，還可用于腫瘤治療[2]。有研究指出，三葉青具有細胞毒性，能誘導細胞凋亡，從而有效抑制肺癌、結腸癌等多種體外培養腫瘤細胞的增殖[3-4]。基于此，本研究以三葉青提取物作用于體外培養的宮頸癌HeLa細胞，分析其對宮頸癌細胞增殖的影響，并探討其作用機制，以期為臨床應用提供參考，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 三葉青提取物制備 三葉青塊根購自寧波圣旺生物科技有限公司，取1kg采用醇提、酸沉淀的方法[4]得三葉青提取物8g。

1.1.2 主要儀器和試劑 細胞培養箱（中國香港Hecnforce公司）；高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標儀、電泳儀、蛋白成像系統（美國BIO-RAD公司）；流式細胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。MTT溶液、0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC、PI（北京Solarbio公司）。

1.1.3 細胞培養 取冷凍保存的人宮頸癌HeLa細胞株于37℃水浴中快速解凍，細胞培養液采用10%胎牛血清加RPMI 1640培養液。細胞培養條件：37℃、5%二氧化碳恒溫、恒濕細胞培養箱，48h換取新鮮培養液，顯微鏡下觀察細胞鋪滿瓶底80%時進行傳代。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖實驗 采用MTT法檢測三葉青提取物對HeLa細胞增殖的影響。取對數生長期的HeLa細胞，以5×104/ml的濃度接種于96孔板，每孔0.1ml；待細胞貼壁后，將細胞分為5組，分別加入三葉青提取物，使其終濃度分別為 0（對照組）、1、2、4、8mg/ml，培養 24 或48h后，每孔加入20μl MTT溶液，繼續培養4h，最后每孔加入100μl DMSO溶液，15min后于570nm波長下測OD值，每個濃度設置6個復孔。細胞抑制率（%）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.2 細胞形態學觀察 以0.25%胰蛋白酶將對數生長期的HeLa細胞消化后接種于6孔板，每孔5×106個細胞。待細胞貼壁后，細胞分組及三葉青提取物干預方式同上。48h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.3 細胞凋亡實驗 將對數生長期的HeLa細胞以每孔5×106個加入6孔板中，細胞分組及三葉青提取物干預方式同上。48h后，離心收集細胞，PBS緩沖液清洗細胞3次，收集的細胞以500μl結合PBS緩沖液重懸，最后用5μl Annexin V-FITC和10μl PI進行染色，常溫下避光反應15min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 細胞相關蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測HeLa細胞遷移相關蛋白基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9，細胞凋亡相關蛋白p53、Bax的表達情況。細胞分組及三葉青提取物干預方式同上。細胞分組處理48h后收集細胞，細胞裂解液裂解細胞，收集總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。以SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜、以5%脫脂奶粉封閉1h、加入一抗（4℃搖床孵育過夜）；PBST洗滌后，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，最后加入顯影液，上機拍照，并進行灰度值分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三葉青提取物對HeLa細胞增殖的影響 與對照組相比，隨著三葉青提取物濃度的增加，HeLa細胞OD值呈逐漸下降趨勢。三葉青提取物處理24h后，除1mg/ml組與對照組無統計學差異外（OD值比較P＞0.05），其余各組均對HeLa細胞的增殖表現出抑制效應（各組OD值比較均P＜0.05），且隨著濃度的增加，抑制效應逐漸增強；而三葉青提取物處理48h后，各組OD值均出現下降（均P＜0.05），且具有濃度依賴效應，見表1。

2.2 三葉青提取物對HeLa細胞形態的影響 顯微鏡下顯示，三葉青提取物處理48h后的HeLa細胞形態逐漸由長梭形或紡錘形變為橢圓形，細胞偽足變短，細胞間隙增寬；且隨著三葉青提取物濃度的增加，鏡下凋亡細胞開始增多，細胞碎片增加，見圖1。

2.3 三葉青提取物對HeLa細胞凋亡的影響 V-FITC/PI雙染流式細胞術顯示，與對照組相比，除1mg/ml組無統計學差異（P＞0.05）外，其余各組凋亡細胞數均明顯增加（均P＜0.05），且呈現濃度依賴性，見圖2。

2.4 三葉青提取物對HeLa細胞相關蛋白表達的影響 與對照組相比，其余各組HeLa細胞MMP-2及MMP-9蛋白表達水平均呈現下降趨勢（均P＜0.05），且MMP-2表達水平與三葉青提取物呈濃度依賴性；而p53與Bax蛋白表達水平與對照組相比均明顯升高（均P＜0.05），且隨著三葉青提取物濃度增加，p53與Bax蛋白表達水平逐漸上升，當三葉青提取物濃度達到8mg/ml時，由于細胞凋亡數量過多，導致該兩類蛋白表達水平出現下降。見圖3。

表1 三葉青提取物對HeLa細胞增殖的影響

圖1 HeLa細胞不同濃度三葉青提取物處理48h后的形態（×400）

圖2 HeLa細胞不同濃度三葉青提取物處理48h后流式細胞圖及凋亡率

3 討論

目前關于三葉青在抗呼吸系統[5]、消化系統[6]等腫瘤作用方面的研究已展開較多，但對抗宮頸癌的作用及其作用機制的研究卻鮮有報道。本研究結果顯示，三葉青提取物對人宮頸癌HeLa細胞表現出一定的增殖抑制作用：與三葉青提取物共培養24h后，2mg/ml組即表現出細胞增殖抑制作用（12.7%）；共培養48h后，1mg/ml組也表現出細胞增殖抑制作用（5.7%），且最高劑量8mg/ml組細胞抑制率達到47.2%。由此可見三葉青提取物對HeLa細胞具有較強的細胞毒性。而細胞形態學觀察及流式細胞術結果也顯示，隨著三葉青提取物濃度的增加，HeLa細胞隨即出現明顯的凋亡特征：細胞質濃縮，變小、細胞核固縮、細胞裂片形成，當藥物濃度達到8mg/ml時，細胞凋亡率達37%，可見三葉青提取物可明顯促進HeLa細胞凋亡進程。

圖3 HeLa細胞不同濃度三葉青提取物處理48h后相關蛋白表達電泳圖和水平比較

細胞凋亡屬于程序化進程，影響細胞凋亡的因子很多。人體p53基因具有抑制腫瘤發生的作用[7]，p53基因在細胞內發生氧化應激、DNA損傷修復、營養缺乏和其他癌基因被激活等情況下可被激活[8]。p53蛋白可通過正向調節Bax等凋亡相關蛋白的合成，引起細胞凋亡[9-10]。鄭倩等[11]以β-氧化石竹烯作用于HeLa細胞，結果顯示β-氧化石竹烯能促進細胞p53蛋白上調誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，三葉青提取物可促進HeLa細胞p53蛋白上調，并進一步上調凋亡蛋白Bax的合成，提示三葉青提取物通過該信號通路促進HeLa細胞凋亡。

癌細胞浸潤是癌癥擴散的病理生理基礎，而癌細胞突破細胞外基質是浸潤的重要過程。基質金屬蛋白酶作為一類離子通道依賴型細胞外基質降解酶，可以促進細胞外基質降解，協助癌細胞轉移[12]。MMP-2與MMP-9高表達與癌細胞遷移能力成正相關[13-14]。姚昭等[15]發現，有機硒作用后的大腸癌Lovo細胞MMP-2與MMP-9表達水平明顯下降，且細胞遷移能力減弱。本研究結果也顯示，三葉青提取物能有效降低HeLa細胞中MMP-2、MMP-9表達水平，且具有藥物濃度依賴性。這提示三葉青提取物可能通過該途徑抑制HeLa細胞侵襲和遷移。

綜上所述，三葉青提取物對宮頸癌HeLa細胞增殖起抑制作用。其或通過上調p53及Bax蛋白表達誘導HeLa細胞凋亡，且具有濃度依賴性；通過下調MMP-2及MMP-9表達影響HeLa細胞侵襲和遷移。