瓜蔞薤白半夏湯調節Apoe-/-小鼠動脈粥樣硬化的療效與機制研究

李金曦，趙吉艷，王均寧，沈仲琪，張義敏，2，董振飛，2*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫經典名方協同創新中心，山東 濟南 250355)

動脈粥樣硬化( atherosclerosis,AS)是心血管系統常見疾病[1],是眾多心腦血管疾病的共同病理基礎[2]。流行病學研究顯示：我國以動脈粥樣硬化為病理基礎的心血管疾病致死、致殘率極高[3]，且呈逐年上升趨勢[4]。《中國心血管病報告2017(概要)》表明，至2017年我國已有心血管病患者2.9億，死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病[5]。積極推進抗AS藥物的藥物研發及研究其藥理作用機制, 對防治AS類疾病具有重要意義[6]。

AS是復雜的慢性進行性疾病，是冠心病的病理基礎，現代臨床中醫常從“胸痹”論治。仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》所創的瓜蔞薤白半夏湯即為治療胸痹的經典名方，因其治療胸痹病效專力宏，故頗受歷代醫家之重視。原文曰：“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之。”此方瓜蔞實一枚、薤白三兩、半夏半升、白酒一斗組成，功擅通陽散結，祛痰寬胸，適用于胸痹痰濁結聚較甚者。

本實驗中使用的Apoe-/-小鼠已成為近幾年研究AS最常用的實驗動物[7]，因其體內缺乏參與脂蛋白轉化代謝的載脂蛋白e基因致使血液中膽固醇堆積而更易形成AS病灶。該模型因其未受物理損傷干預，發病過程及病變部位與人類十分相似而成為目前研究AS類疾病的極佳動物模型[8]。本研究通過復制Apoe-/-小鼠AS模型，對瓜蔞薤白半夏湯調節血脂代謝、減小主動脈斑塊面積、改善血管內皮功能等方面進行研究，探討瓜蔞薤白半夏湯抗AS的作用機制，為該方臨床應用提供現代醫學依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

瓜蔞、薤白、清半夏購于濟南建聯中藥店，許可證號：魯20160039；糯米酒(酒精度8%)購于濟南大潤發超市，許可證編號：SC10333021205725。辛伐他汀片，世貿天階制藥(江蘇)有限責任公司，H20063015。

1.1.2 動物與飼料

32只SPF級健康雄性Apoe-/-小鼠，8周齡，體質量18～22 g和同遺傳背景C57BL/6J小鼠8只，8周齡，體質量18～22 g；購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物質量合格證號：SYXK(魯)20110019；動物飼養于山東中醫藥大學實驗室IVC獨立通風系統小鼠籠。高脂飼料由山東解螺旋生物科技有限公司提供 (TP-26300),普通飼料( SCXK魯 20180003)與動物墊料均由濟南朋悅公司提供，均經過高溫滅菌處理。本研究中所有動物實驗飼養及操作嚴格遵守國家動物福利倫理與保護相關規定。

1.1.3 主要設備和器械

電子天平：杭州萬特衡器有限公司；移液器：Finnpipette；全自動雪花制冰機：上海政泓實業有限公司；立式壓力滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司，SQ510C；高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；酶標儀：Rayto，RT-6100；電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司，HWS-26型。

1.1.4 主要試劑

小鼠氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02354M2);小鼠一氧化氮(NO)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02938M1);小鼠內皮素1(ET-1)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02844M2);小鼠血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02490M1)。

1.1.5 中藥制備

瓜蔞薤白半夏湯原方換算如下：瓜蔞實(搗碎)30 g，薤白45 g，半夏60 g。以上為成人每日所需用藥劑量，按小鼠體表系數9.1折算得等效劑量。瓜蔞4.55 g/kg,薤白6.825 g/kg,半夏9.1 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

適應性飼養1周后，Apoe-/-小鼠給予高脂飼料飼養，自由飲水，持續時間12周。

1.2.2 分組及給藥

12周末造模結束，Apoe-/-小鼠隨機分為GXBD組、辛伐他汀組、模型對照組，每組各8只，持續高脂飲食。C57BL/6J小鼠設為空白對照組，普通飼料喂養。按體質量灌胃給藥，每日1次，連續10周。

1.2.3 動物組織采集與處理

取材前夜動物禁食不禁水，麻醉后固定，剪開腹部，進行下腔靜脈取血靜置2 h，3 000 r/min，低溫高速離心15 min，取上清，置于-80 ℃保存。取血后剪開胸腔，剪去胸骨，暴露心臟，自主動脈根部至髂總動脈分支處完整分離主動脈，完整取出主動脈，置于PBS緩沖液洗凈血液，并分離凈多余脂肪組織及纖維組織后置于4%多聚甲醛固定。

1.2.4 血清指標

采用全自動生化分析儀檢測血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平。酶聯免疫吸附試驗測定血清NO、ET-1、AngⅡ、OX-LDL的濃度。

1.2.5 組織病理分析

主動脈油紅O染色，觀察小鼠主動脈內脂質沉積及斑塊面積，測量主動脈斑塊面積(PA)和管腔面積(LA)，計算斑塊面積與管腔面積之比(PA/LA)。主動脈HE染色切片，觀察主動脈組織結構的病理改變。

1.2.6 數據處理

2 結果

2.1 小鼠主動脈油紅O染色

油紅O染色能特異性地使組織和細胞內脂質以及脂蛋白等染色，呈紅色部位說明存在動脈粥樣硬化斑塊。如圖2所示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠PA/LA顯著增加(P<0.01); 與模型對照組相比, GXBD組的PA/LA顯著降低(P<0.01)。見圖1、圖2。

2.2 主動脈橫截面HE染色

圖3A：正常對照組,血管平滑肌細胞形態結構正常，排列規則，各層分界清晰，血管內皮結構完整，未見明顯炎癥，未見AS斑塊形成。圖3B：模型對照組,血管內膜增厚，動脈血管管腔出現粥樣硬化斑塊，血管平滑肌細胞形態結構紊亂，排列不規則，有散在泡沫細胞和炎癥細胞。圖3C：GXBD組,血管平滑肌細胞形態結構正常、分界清晰、排列規則；血管腔內可見少量脫落的細胞。圖3D：辛伐他汀組,血管平滑肌細胞形態結構正常、分界清晰、排列規則；血管腔內可見較多脫落的細胞(黑色箭頭)，并伴有單個淋巴細胞浸潤。

圖1 主動脈油紅O染色

圖2 斑塊面積/管腔總面積(PA/LA)

2.3 瓜蔞薤白半夏湯對Apoe-/-敲除小鼠血脂的影響

AS的發生是由于脂質聚集在血管壁，伴隨復合糖類積聚、纖維增生和鈣質沉著，因此調節和減少脂質聚集對于抗AS有著重要意義[9]。結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組血清中的TC、TG、LDL-C水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)，HDLC明顯降低(P<0.01)，GXBD組TC、LDL-C水平較模型組顯著降低(P<0.01)，TG有降低趨勢(P>0.05)，HDL-C水平較模型組升高(P<0.05)，見表1，圖4～7。

注：A正常對照組；B模型對照組；C GXBD組；D辛伐他汀組圖3 主動脈形態學改變 HE染色(HE×200)

2.4 瓜蔞薤白半夏湯對Apoe-/-小鼠血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的檢測

與空白組比較，模型組NO濃度顯著降低(P<0.01)，給藥干預后，瓜蔞薤白半夏湯組NO表達量相對模型組顯著升高(P<0.01)，模型組ET-1與空白組相比顯著升高，中藥組顯著降低(P<0.01)，可以說明瓜蔞薤白半夏湯干預能升高血清NO的表達，減少ET-1的表達，能夠有效的改善血管收縮舒張功能的紊亂。模型組AngⅡ與空白組比較顯著升高(P<0.01)，中藥組AngⅡ表達量相對模型組有顯著降低(P<0.01)，模型組ox-LDL與空白組相比顯著升高，中藥組顯著降低(P<0.01)，說明瓜蔞薤白半夏湯的干預能夠減輕氧化損傷，緩解血管平滑肌緊張，有效改善血管收縮舒張功能的紊亂,見表2,圖8～11。

表1 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠血脂水平的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 瓜蔞薤白半夏湯對血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖4 瓜蔞薤白半夏湯對TC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖5 瓜蔞薤白半夏湯對TG的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖6 瓜蔞薤白半夏湯對HDLC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖7 瓜蔞薤白半夏湯對LDLC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖8 瓜蔞薤白半夏湯對血清NO的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖9 瓜蔞薤白半夏湯對血清ET-1的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖10 瓜蔞薤白半夏湯對血清AngⅡ的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖11 瓜蔞薤白半夏湯對血清ox-LDL的影響

3 討論

《內經》云：“脈不通則血不流。”中醫學認為“心主血脈”，AS的發生主要由于心主血脈功能的失調，血脈不通，脈體失養所致。若心陽不振，導致血液運行失去動力，從而發生氣滯血瘀，使血行遲滯，血脈痹阻。本研究采用Apoe-/-小鼠采用高脂飲食喂養12周，發病機理為過食肥甘厚膩，阻礙脾胃，運化不利，痰濁內生，結聚脈絡，阻滯血脈，血脈通行受阻致病。

研究表明，瓜蔞薤白半夏湯的現代藥理學作用機制主要表現為再灌注時對心肌損傷的保護，抑制血小板聚集[10]、抗心肌缺血[11]等方面，現代臨床中，該方在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療中療效顯著。AS被認為是動脈壁的慢性炎癥性疾病[12]，內皮功能的障礙是AS發生的初始步驟[13]，研究顯示，該方可通過調節脂質代謝，抑制氧化應激，減輕炎癥反應等多種機制有效抑制動脈血管內皮的損傷。在血管內皮受到損傷后，內皮屏障功能減弱，從而引起脂質浸潤增加，白細胞黏附遷移、NO生物活性減低、平滑肌細胞增殖、斑塊的不穩定性增加，引起血栓的形成[14]。血管收縮因子主要包括內皮素(ET)、血管緊張素(Ang)、血栓素(TXA)等，ET-1由血管內皮細胞分泌，是NO的反向調節物質，ET-1水平與AS嚴重程度呈正相關，內皮損傷或ET釋放增加，會增強血管收縮，促進平滑肌增生，致使斑塊形成和擴大，引起血管重塑障礙。血管舒張因子主要包括一氧化氮(NO)，前列腺素(PGI)等。據1980年，Furchgott和Zawadzki的首次報道證實了內性NO作為天然血管保護因子和抗動脈粥樣硬化分子具有重要的病理生理學意義[15]。內皮細胞依賴性的血管收縮舒張功能是目前公認的內皮功能障礙評價標準[16]，內皮功能障礙是導致AS發生的始動環節，因此，本研究認為對內皮功能紊亂進行有效干預和改善成為防治AS的重要環節，本實驗方案的確定立足于血管收縮與舒張功能的紊亂是AS發生的重要因素，動脈血管內皮損傷是導致AS發生的主要條件，NO的產生減少引起的內皮舒張功能減弱是血管內皮功能紊亂的直接原因，通過檢測NO、ET-1系統的平衡，及AngⅡ、ox-LDL的表達，試圖進一步揭示瓜蔞薤白半夏湯對動脈血管內皮的保護功能，抑制AS發展的機制。

本研究以Apoe-/-小鼠給予高脂飲食飼養復刻AS模型，探討了瓜蔞薤白半夏湯在調節血脂水平，調節主動脈斑塊面積，以及調節血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ方面的作用。研究結果顯示，GXBD組小鼠血清TC、TG、LDL-C與模型組相比明顯下降(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，說明瓜蔞薤白半夏湯可以較好的改善小鼠血脂水平。油紅O染色顯示瓜蔞薤白半夏湯能明顯減小主動脈斑塊面積；HE染色結果顯示瓜蔞薤白半夏湯組血管平滑肌細胞形態結構正常、分界清晰、排列規則，說明瓜蔞薤白半夏湯能有效抑制小鼠動脈AS的形成與發展。瓜蔞薤白半夏湯組血清NO的表達較模型組顯著升高(P<0.05)，ET-1、ox-LDL、AngⅡ較模型組顯著降低(P<0.05)，說明瓜蔞薤白半夏湯能夠有效保護血管內皮、減輕氧化損傷，緩解血管平滑肌緊張，改善血管收縮舒張功能紊亂，調節血管內皮功能障礙。以上研究結果表明，瓜萎薤白半夏湯給藥干預10周能夠顯著抑制高脂飲食12周誘導的動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊的發展，其調節血脂水平，升高血清NO濃度，抑制血清ET-1、ox-LDL、AngⅡ表達的作用，可能是其防治AS的部分機制。