霾黃金中藥茶急性毒理試驗研究

劉芳，馬婷婷，汪蕾，江紹偉，肖凌*

(1.協和武漢紅十字會醫院急診科，湖北 武漢 430010；2.湖北中醫藥大學檢驗學院，湖北 武漢 430065)

近些年來，隨著空氣質量逐漸惡化，霧霾出現的頻率越來越高，霧霾中含有很多顆粒性污染物，在PM2.5相關的研究中[1-3]發現，主要引起肺部的炎癥和氧化應激反應。運用傳統醫學采用中藥預防是可行的方法。根據專利“一種清肺潤肺茶的生產方法”(專利號：ZL201410124446.5)生產的清肺潤肺茶霾黃金，主要由清肺潤肺健脾的藥食同源中藥制成，用于對霧霾傷害的預防，成分包括玉竹、羅漢果、甘草、橘皮、蘆根、薏苡仁、余甘子、百合(按劑量高低排列，具體劑量受專利保護)8味中藥。本試驗擬對霾黃金進行毒理試驗，對霾黃金安全性作進一步研究。

羅漢果具有清熱潤肺、利咽開音和滑腸通便作用。蘆根具有清熱瀉火、生津止渴、除煩止嘔作用，但脾胃虛寒者慎服蘆根。百合具有養陰潤燥、清心安神作用，目前幾乎未有相關毒副作用的報道。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的作用。薏苡仁具有利水滲濕、健脾止瀉、排膿解毒的作用，也對癌細胞有阻止生長和殺傷作用，但消化功能弱者慎食。陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的作用，急性毒性作用小。余甘子具有生津止咳、清熱涼血、消食健胃的作用，其暫未查到明顯毒理作用。玉竹的有毒成分為鈴蘭苷或苓蘭苷，過量可引起中毒。綜合以上內容，我們設計了急性毒理試驗，重點評估霾黃金中藥茶對胃腸功能、肝腎功能及血糖的影響。

試驗采用最大耐受法對小鼠進行急性毒理試驗，通過觀察小鼠在灌胃后的飲食和排泄情況，統計體質量變化評估其對胃腸功能的影響；通過檢測小鼠血清的相關生化指標及肝腎病理切片評估其對肝腎功能，檢測血清葡萄糖評估霾黃金中藥茶對血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

40只SPF級昆明小鼠購自三峽大學試驗動物中心(動物合格證號：No42010200002114,單位許可證編號：SCXK(鄂) 2017-0012)，日齡為35～37 d。購買后在適宜溫度和濕度下適應性飼養1周后，40只KM小鼠平均體質量為(29.87±1.58)g。

1.2 分組方法

將適應性飼養后的40只KM小鼠隨機編號，然后通過產生1～40之間的隨機數的方法先后分為A,B,C,D四組，每組10只。試驗期間，參考動物試驗通用要求，遵循相關動物保護和使用指南，并獲得單位倫理委員會批準。

1.3 試驗試劑與器材

霾黃金(取自商品霾黃金伴侶茶，許可證編號：SC10642011801427，2018/07/15)；離心機(北京京立離心機有限公司，型號：LD5-2A)；生化試劑盒葡萄糖(批號：180851)、肌酐(批號：180651)、總蛋白(批號：180791)、甘油三酯(批號：191041)均來自中生北控生物科技股份有限公司；分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司，型號：723N)。

1.4 試驗方法

40只KM小鼠分為A,B,C,D四組，A組為對照組(灌相應體積的去離子水)，B,C,D組受試物劑量設3個劑量組(正常劑量的1倍，10倍，100倍)。

1.4.1 劑量換算

霾黃金一包為的劑量為1.5 g，參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》[4]，根據體表面積換算法，人和小鼠(20 g)間按體表面積折算的等效劑量比值為0.002 5，算得相當于小鼠劑量為0.187 5 mg/g。A,B,C,D四組的劑量分別為0，0.187 5，1.875，18.75 mg/g。但100倍正常劑量時溶液呈高度黏稠狀無法進行灌胃，所以統一將濃度稀釋50%后分2次灌胃，小鼠灌胃容量為0.015 mL/g，每日灌胃溶液需新鮮配制。

1.4.2 灌胃

用1 mL的注射器配已消毒滅菌的8號灌胃針頭對小鼠進行灌胃。各組小鼠灌胃前隔夜停食16 h(不限制飲水)，第1次灌胃結束后將小鼠放回籠中，間隔4 h后進行第2次灌胃，并且每次灌胃前需禁食禁水2 h。每日灌胃結束后投放飼料和水供小鼠自由飲食，期間并記錄小鼠的死亡情況，觀察小鼠的行為，外觀，對刺激的反應，排泄物及分泌物情況，連續灌胃10日。

1.4.3 取材

摘眼球取血：于第14日對小鼠禁食24 h后，采用摘取眼球的方法對小鼠進行采血。將采集的血液置于干燥的EP管內，靜止0.5 h后3 500 r/min離心10 min(離心力為2 100 g,離心半徑約15 cm)，吸取每管的上層血清于新的干燥EP管內，貼好標簽，于4 ℃冰箱內保存。

小鼠肝腎取材：眼球取血后的小鼠立刻進行解剖，取小鼠的肝臟和腎臟，取得的臟器置于裝有組織固定液(4%多聚甲醛)的EP管內固定保存，外送石蠟包埋。

1.4.4 病理切片制作

取回的石蠟包埋好的臟器固定于切片機上切成5～8 μm的薄片，切下的薄片展于40 ℃水浴并用鑷子將蠟片分離開，選擇最佳的薄片，置于載玻片上放入37 ℃烤片機中24 h晾干[5]。晾干后的切片進行HE染色，最后封片并加蓋蓋玻片，在顯微鏡下進行鏡下觀察。

1.4.5 指標測定

生化指標的檢測：用分光光度分析的標準曲線法對取好的小鼠血清進行生化指標的測定。

1.5 統計學方法

本試驗采用t檢驗進行統計學分析，運用的統計學軟件為SPSS 23.0。

2 結果

2.1 灌胃后小鼠體質量飲食行為記錄

第1天，第7天和第14天的平均體質量記錄見表1，從數據和結果中看出各組小鼠的體質量持續增長，且試驗組小鼠體質量與對照組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)。

試驗期間未見小鼠死亡。灌胃期間小鼠的進食進水及行動應激能力并無異常，觀察小鼠排泄物，可見D組小鼠大便顏色略深，其余性狀并無異常。

表1 灌胃期間小鼠體質量表

2.2 生化指標測定結果

取得的小鼠血清均為黃色透明，新鮮無溶血。用標準曲線法求得葡萄糖，總蛋白，肌酐，甘油三酯的相應濃度，對每組的各項生化指標的平均值進行統計學指標計算及差異分析見表2。

表2 小鼠血清生化指標

從表中可看出試驗組B,C,D組的葡萄糖，總蛋白，肌酐，甘油三酯測量值與對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 組織病理學

小鼠肝，腎HE染色的片子在正置顯微鏡下進行組織形態觀察，拍攝的圖片見圖1，圖2。從病理切片染色結果可看出與對照組A組相比，試驗組B,C,D組小鼠的肝腎并未出現炎癥改變、細胞水腫、脂肪變性等急性毒理改變。

圖1 小鼠肝臟石蠟切片HE染色(從左到右分別為A,B,C,D組，×400)

圖2 小鼠腎臟石蠟切片HE染色(從左到右分別為A,B,C,D組，×400)

3 討論

近年來大氣污染問題日益嚴重，霧霾天氣及其主要成分 PM2.5成為危害人體健康的重要元兇，在相關研究中，霧霾可通過影響肺組織ATP的產生和免疫功能來引起肺功能的損傷[6-7]。霾黃金中藥茶是一種清肺潤肺中藥茶，在研究其對霧霾損傷的防護作用之前做了此次急性毒理試驗。

急性經口毒性試驗傳統方法可分為霍恩氏法，寇氏法[8]。但本試驗為中藥保健茶，測LD50較為困難，故參考相關文獻[9-12]，本試驗采用最大耐受法對小鼠進行急性毒理試驗，灌胃劑量分別設為正常劑量的1倍，10倍和100倍。由于該產品10 d為1周期，故對小鼠連續灌胃10 d。根據GB 15193.1-2014食品安全國家標準食品安全性毒理學評價程序，動物毒性試驗結果外推到人的不確定系數通常為100，本試驗中最大劑量組為正常劑量的100倍。

霾黃金中藥茶為八種藥食同源中藥進行配伍制備，其主要功效是清肺潤肺健脾。急性毒理試驗主要涉及其對小鼠胃腸和肝腎功能影響進行評估。鑒于霾黃金茶口感回甘，本試驗亦對試驗小鼠血糖進行評估。試驗結果顯示，試驗組的小鼠在連續灌胃后體質量，飲食，行為和排泄情況等均無異常，胃腸功能正常；試驗組小鼠血清總蛋白、肌酐、甘油三酯與對照組相比差異均無統計學意義，HE染色的病理切片分析，未見試驗組小鼠的肝腎發生病理學改變，表明霾黃金中藥茶對肝腎功能無影響。試驗組小鼠血清葡萄糖與對照組無統計學差異，顯示其對血糖無影響。綜上，潤肺清肺中藥茶霾黃金不影響小鼠胃腸功能、肝腎功能及血糖，不引起急性毒理改變，使用安全。