甘草種子與種苗質量分級標準研究△

李文斌，尚興樸，陳彩霞，羅琳，閆濱濱，鄧庭偉，侯俊玲，4*，王文全，，4*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國中藥有限公司，北京 100195；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 102488；

種子種苗是中藥材生產的物質基礎，優良品種及優質的種子種苗是實現中藥材規范化生產的基礎和首要條件[1]。目前，中藥材種子種苗生產與流通存在質量標準缺乏或不完善、經營不規范的問題，與農作物、煙草種、草種等的品種選育和種子種苗標準化的進程相比還非常落后。而中藥材質量的穩定需要中藥材生產的規范化，中藥材生產的規范化需要中藥材種子種苗生產的標準化。隨著中醫藥產業的發展，中藥材種子種苗質量標準研究的重要程度日益顯現。

甘草為豆科多年生植物，以根和根莖入藥，為我國常用大宗藥材。目前，栽培甘草已經成為甘草藥材商品的主流，種植方式主要為種子直播與種苗移栽，而質量分級標準的缺乏與不完善也是導致甘草藥材質量不穩定的重要原因[2-3]。因此，對全國主產區所流通的甘草種子、種苗開展質量分級標準的研究，以期為甘草藥材的規范化生產提供科學依據與指導。

1 材料

1.1 種子材料

甘草種子于2016年9月分別搜集于內蒙古、甘肅、新疆等地，經中國醫學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的種子。種子產地來源信息見表1。

1.2 種苗材料

2017年4—6月，對我國甘草主要分布區的生產用種苗進行收集、調查，收集到8個批次的甘草種苗樣品，共4994株，收集數據1600組。經中國醫學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草G.uralensisFisch.的種苗。種苗產地來源信息見表2。

表1 甘草種子的來源信息

注：A.中藥材專業市場收集；B.地方商戶收集；C.藥材產地收集；D.從植株直接采集。

表2 甘草種苗的產地信息

2 方法

2.1 產量與質量指標的收集方法

甘草種子的發芽率、凈度、千粒質量、含水量的測定方法參照GB/T 3543.1—3543.7《農作物種子檢驗規程》與于福來等[4]的研究結果。使用卷尺與游標卡尺分別測量種苗的根長與蘆頭直徑(蘆頭下1 cm處直徑)，鉤秤測定百株質量。參考金燕清等[5]的測定方法測定甘草酸、甘草苷的相對含量。

2.2 種子、種苗質量分級方法

甘草種子質量分級方法采用K-均值聚類法對30份甘草種子的發芽率、凈度2個質量指標數據進行K-均值聚類分析。含水量采用標準差法。

甘草種苗質量分級方法，根長和蘆頭直徑采用標準差法，平均值加1倍的標準差作為一、二等的分界點，平均值作為二、三等的分界點，平均值減1倍標準差為三等的下限點。百株質量采用平均值法，各級種苗的百株質量平均值作為各級種苗的上限，對所調查種苗樣本進行初步分級。所得數據用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2.3 田間試驗布置

根據實驗室分級結果，分別選擇一、二、三級以及混合等級種子進行田間比較試驗。試驗地點設于北京中國醫學科學院藥用植物研究所試驗田，砂質壤土。小區面積2 m2，3次重復。采用條播方式，行距15 cm，用種量約700粒/小區。小區間設置20 cm為保護行(隔離區)。2017年10月上旬對影響甘草藥材產量的根系參數進行調查。每個小區取15株用于根參數調查，并對單株質量及單位面積的藥材產量進行統計。

根據種苗初步分級結果，分別選擇一、二、三級以及等外等級種苗進行田間比較試驗。試驗地點設在甘肅民勤農田地，砂質壤土。小區面積2 m2，3次重復。各等級種苗采用平栽方式，行距15 cm，每個小區100株。小區間設置20 cm為保護行(隔離區)。為了降低由于出苗率導致的株行距改變帶來的影響，于2017年7月下旬利用儲備的同一批材料進行補栽。2017年7月下旬對出苗率進行調查。分別于2017年10月上旬、2018年10月上旬進行取樣，每小區取10株用于根參數調查，并對單株質量及單位面積的藥材產量進行統計。

3 結果與分析

3.1 甘草種子質量分級

3.1.1種子質量分級指標的確定 發芽率、含水量、凈度、千粒質量、純度、生活力等指標常在甘草種子質量標準的制定中被使用(見表3)[6]。其中，發芽率是甘草發芽能力的重要指標，是種子內在質量的反映，為種子等級劃分的決定性指標。凈度是反映甘草商品性狀的重要指標，在甘草種子的流通中，經常混有大量的雜質，給生產帶來嚴重影響，因此適當提高凈度標準有利于甘草種子商品質量的整體提高。甘草千粒質量受種質影響大，不同種質千粒質量差異顯著[7]。含水量受氣候影響大，主要影響種子貯藏。因此，選擇發芽率、含水量作為甘草種子質量分級的主要指標，千粒質量和含水量作為重要的定性指標。

表3 甘草種子的部分質量標準

3.1.2種子質量分級 通過測定30份甘草種子的發芽率、凈度、千粒質量和含水量(見表4)，并采用K-均值聚類法對30份甘草種子的發芽率、凈度2個指標數據進行聚類分析，共分成3類，即3個等級(見表5)，方差分析表明，不同種子間發芽率、凈度差異有統計學意義(P<0.05)。而不同野生甘草種群種子的千粒質量差異有統計學意義，含水量與種子貯藏有關，因此只作為這2項指標作為定性指標：千粒質量的平均值為(10.95±1.33) g，最小值為8.5 g，千粒質量一般為8～14 g，因此將8 g作為甘草種子的下限；含水量的平均值為(8.82±1.30)%，因此采用標準差法取其上限10.12%。依據以上結果形成草案，以此開展驗證性實驗。結合驗證實驗結果、甘草種子流通與生產實際，對種子質量分級標準草案進行調整。同時為解決不同等級的等距問題，以使標準更具操作性。將各指標尾數采用05或5-10且逢2.5進位取整法進行修約，并將等外級別舍掉，結果見表6。

表4 不同來源甘草種子發芽率、凈度、千粒質量及含水量

表5 甘草種子分級指標K-均值聚類結果 %

表6 甘草種子分級標準

3.1.3不同等級種子間產量相關指標的比較 由表7可看出，3個等級間的根系參數有一定的不同，但差異無統計學意義，各等級單位面積保苗數與單位面積產量之間差異有統計學意義(P<0.05)，且一級>二級>三級。

單位面積產量(g)=單位面積保苗數(株)× 單株質量(g)

(1)

當各等級間的單根質量相似時，單位面積產量之間的差異來源于單位面積保苗數的差異。

單位面積保苗數(株)=[單位面積播種量(g)× 凈度(%)×發芽率(%)×出苗率(%)]/ 千粒質量(g)

(2)

可見發芽率、凈度與單位面積保苗數呈正相關。因此發芽率和凈度不同的不同等級甘草種子，通過影響單位面積保苗數，最終影響單位面積產量。

3.2 甘草種苗質量分級

3.2.1種苗質量分級指標的確定 根長、蘆頭下1 cm處直徑、蘆頭下20 cm處直徑、單株質量為與藥材產量相關的重要指標[8-9]，根長、蘆頭下1 cm直徑、蘆頭下20 cm直徑用于描述種苗和藥材的形態，單株質量則直接與產量相關。但蘆頭下20 cm直徑與單株質量的測量在實際生產中不易操作，在種苗采購中百株質量為1項重要指標，常用來計算1批種苗的平均單株質量。因此采用根長、蘆頭下1 cm直徑、百株質量這3個指標用于甘草種苗的質量分級。

3.2.2種苗質量分級 測定1600株甘草種苗根長和蘆頭直徑，結果顯示：平均蘆頭直徑為(0.59±0.24) cm，平均根長為(35.84±9.59) cm，可見，甘草種苗在不分級的情況下，不同個體在蘆頭直徑和根長指標方面相差很大。按照2.2項下方法進行分級，甘草種苗各等級的實際頻數分布顯示(見表8)，一級苗為9.22%，二級苗為30.69%，三級苗為35.79%，等外苗為24.30%，合格率為75.70%，種苗各等級所占比例、合格率與種源、密度、田間管理有關，其中，內蒙種源種苗合格率高于較新疆種源種苗、一級種苗率。根長和蘆頭直徑采用標準差

表7 不同等級種子間產量相關指標

注：處理間多重比較采用LSD法。同列字母表示P<0.05。下同。

表8 甘草種苗各樣本的指標分布情況

法，百株質量采用平均值法，各級種苗的百株質量平均值作為各級種苗的上限，為了限定三級苗百株質量的下限，設置8批種苗中的三級苗的最小值0.20 kg作為三級苗的下限。依據種苗根長、蘆頭直徑以及百株質量的測定結果進行初步分級，依據以上結果形成草案，以此開展驗證性實驗。結合驗證實驗結果甘草種苗流通和生產實際，對種苗等級初步聚類結果進行調整，結果見表9。

表9 甘草種苗質量分級標準

3.2.3不同等級種苗間產量相關指標的比較 由表10可知，不同等級的種苗的出苗率差異有統計學意義(F=199.42)，隨著等級的下降，出苗率逐漸下降。不同等級的種苗在移栽1年后的藥材在根長、蘆頭直徑、單株質量3個指標方面差異有統計學意義：一級、二級、三級種苗的根長差異無統計學意義，但均與等外等級差異有統計學意義(F=10.64)；前三級與等外的蘆頭直徑差異有統計學意義(F=43.53)；各級的單株質量差異有統計學意義(F=64.41)，且一級>二級>三級>等外。各級在單位面積的產量間差異有統計學意義(F=464.99)，二級和三級差異無統計學意義，原因是二級種苗的株數為41株，三級種苗為48株，屬于取樣帶來的誤差，但二級種苗單位面積產量的平均值要大于三級。

表10 移栽1年后不同等級種苗間產量相關指標

表11 移栽2年后不同等級種苗間產量相關指標

由表11可知，不同等級的種苗在移栽2年后的藥材在根長、蘆頭直徑、單株質量3個指標方面存在差異有統計學意義：一級、二級、三級種苗的根長差異無統計學意義，但均與等外等級差異有統計學意義(F=3.26，P<0.028 0)；前三級與等外的蘆頭直徑差異有統計學意義(F=28.53)，且一級>二級>三級>等外；在單株質量方面，各等級差異有統計學意義(F=44.38)，一級與二級顯著大于三級與等外。各等級在單位面積的產量間差異有統計學意義(F=30.82)，隨著等級逐級下降。

3.2.4不同等級種苗間質量相關指標的比較 據表12結果顯示：移栽1年后，不同等級的種苗在甘草酸、甘草苷含量方面差異有統計學意義：一級和二級種苗對應藥材中的甘草酸含量顯著(F=6.15，P<0.017 9)高于等外種苗對應的藥材，前3級甘草酸含量差異無統計學意義，但均值依次下降。前3級甘草苷含量(F=16.54，P<0.000 9)高于等外；移栽2年后，不同等級在甘草酸、甘草苷含量方面差異有統計學意義：前3級種苗對應藥材中的甘草酸含量顯著(F=35.61)高于等外種苗對應的藥材，一級和二級的甘草酸含量差異有統計學意義，與三級、等外相比均值依次下降；不同等級中甘草苷含量差異規律與甘草酸差異規律相似(F=69.44，P<0.000 1)。可見，不同等級種苗移栽1年和2年后，前3級種苗所對應的藥材質量均優于等外等級。

表12 不同等級種苗間質量相關指標 %

3.2.5不同等級種苗的綜合評價 利用主成分分析法分別對不同等級種苗移栽1年與移栽2年后藥材的產量與質量進行綜合評價。對不同等級種苗移栽1年藥材的4個產量相關指標、2個質量相關指標以及出苗率指標進行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將7個指標簡化為2個因子，累計貢獻率達97.67%，包含了7個指標的絕大部分信息。計算各等級種苗的主成分得分，依次為2.26、0.82、-0.54、-2.54，即在出苗率、產量、質量3個方面的綜合評價中一級種苗最高，二級和三級種苗依次次之，且均高于等外種苗。

利用相同方法對不同等級種苗移栽2年后藥材的4個產量相關指標、2個質量相關指標進行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將6個指標簡化為1個因子，累計貢獻率達93.20%，包含了6個指標的絕大部分信息。計算各等級種苗的主成分得分，依次為2.66、0.94、-0.72、-2.88，即在產量、質量2個方面的綜合評價中一級種苗最高，二級和三級種苗依次次之，且均高于等外種苗。

4 結論與討論

甘草種子質量等級劃分為3個等級，各級甘草種子的千粒質量不低于8 g，含水量不低于10%，一級種子：發芽率≥90%，凈度≥90%；二級種子：90%>發芽率≥85%，90%>凈度≥85%；三級種子：85%>發芽率≥80%，85%>凈度≥80%，經驗證，甘草種子質量等級劃分合理，以上3個等級的種子規定為合格種子，在實際生產中定級時，任一指標不滿足最低等級時，定為不合格種子，指標不能同時滿足同一等級標準要求時，按照最低指標滿足的等級進行定級，例如：千粒質量和含水量滿足要求，發芽率為95%，凈度為82%時，則定為三級種子。與孫群等[6]、張國榮等[10]的研究結果相比，只將發芽率與凈度作為等級劃分的指標，簡化了檢測步驟，更便于在生產實踐中應用。甘草種子等級主要影響單位面積保苗數，后期的生長將受到株行距改變的影響，單株質量會產生一定的差異，但在規范的田間管理下，種植3年后的產量依然是受保苗數的影響較大。

甘草種苗質量等級劃分為3個等級，一級種苗：根長≥45 cm，蘆頭直徑≥0.8 cm，1.3 kg≤百株質量<0.8 kg；二級種苗：45 cm>根長≥35 cm，0.8 cm>蘆頭直徑≥0.6 cm，0.8 kg≤百株質量<0.4 kg；三級種苗：35 cm>根長≥25 cm，0.6 cm>蘆頭直徑≥0.4 cm，0.4 kg≤百株質量≤0.2 kg，經驗證，甘草種苗質量等級劃分合理，以上3個等級的種苗規定為合格種苗，在實際生產中定級時，種苗的根長和蘆頭直徑作為分級操作的參照指標，而百株質量作為分級操作后檢測復查的參照指標，當任一指標超出質量分級標準范圍時，定為不合格種苗，指標不能同時滿足同一等級標準要求時，按照最低指標滿足的等級進行定級。同時，通過移栽后1年和移栽后2年的數據進行對比，發現其研究結果一致，說明已經分級的種苗在合理的采收年限內，不存在越級的情況。在田間對比試驗中并未使用肥料，移栽2年后的藥材，一級和二級的甘草酸和甘草苷含量均符合《中華人民共和國藥典》標準，等外的甘草酸和甘草苷含量則未達《中華人民共和國藥典》標準，三級雖未達標，但其含量均接近《中華人民共和國藥典》標準。金燕清等[5]和張豆豆等[11]的研究結果顯示，通過合理配施氮磷鉀肥料可以有效提高甘草酸和甘草苷的含量與藥材產量。可見，在規范的田間管理下合格種苗在移栽2年后均可以符合《中華人民共和國藥典》標準。