基于UPLC-MS/MS對(duì)木蝴蝶配方顆粒6種成分含量測(cè)定及特征圖譜研究△

何民友，魏梅，程學(xué)仁，王利偉，吳淑珍，索彩仙，李國(guó)衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

木蝴蝶為紫葳科木蝴蝶屬木蝴蝶Oroxylumindicum(L) Vent.的干燥成熟種子[1]。木蝴蝶始載于《滇南本草》，原名千張紙，《本草綱目拾遺》始名木蝴蝶[2]。其味苦、甘，涼，入肺、肝、胃經(jīng)，有清肺利咽、疏肝和胃之功效。已有的文獻(xiàn)報(bào)道[3]中指出，在木蝴蝶成熟種子中含有大量具有生物活性的黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩苷元、白楊黃素、槲皮素等。現(xiàn)代藥理醫(yī)學(xué)研究表明，木蝴蝶具有抗炎、抗氧化、抗癌、降糖、抑制病毒及腫瘤生長(zhǎng)等多種藥理作用[4-9]。具有藥理活性化學(xué)成分脂肪油、黃芩苷元-7-葡萄糖苷、黃芩苷、黃芩苷元、千層紙素A、木蝴蝶苷B、白楊素、白楊素-7-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物[10]。

木蝴蝶配方顆粒是木蝴蝶飲片經(jīng)水提取后制粒而成，供臨床調(diào)配組成復(fù)方湯劑使用，具有免煎易服、水沖即溶、攜帶方便、劑量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于木蝴蝶配方顆粒的化學(xué)成分和藥理的文獻(xiàn)較少，且還沒有建立利用某些特征性的化學(xué)成分對(duì)木蝴蝶配方顆粒進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的方法。通過文獻(xiàn)研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，關(guān)于木蝴蝶黃酮類成分含量測(cè)定的報(bào)道多以槲皮素、木蝴蝶苷B、黃芩苷和黃芩素等成分測(cè)定為主，因各化學(xué)成分最大吸收波長(zhǎng)不一，要實(shí)現(xiàn)一法測(cè)定多指標(biāo)成分含量需通過全時(shí)段多波長(zhǎng)融合來實(shí)現(xiàn)[14]。黃酮類化合物在植物體內(nèi)大部分與不同的糖結(jié)合成苷，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，不易測(cè)定。常用黃酮類物質(zhì)測(cè)定方法有分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。分光光度法測(cè)定由于雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，導(dǎo)致準(zhǔn)確性差，難重現(xiàn)；高效液相色譜法對(duì)分離度要求高[15]。基于此，本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[16-17]的基礎(chǔ)上，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)同時(shí)測(cè)定該類物質(zhì)的方法，能有效快速測(cè)定木蝴蝶配方顆粒中6種黃酮類化學(xué)成分的含量；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還建立木蝴蝶配方顆粒特征圖譜，為中藥木蝴蝶的多指標(biāo)質(zhì)量控制和較全面質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

UPLC-MS是目前廣泛應(yīng)用的分析方法之一。它利用液相色譜的高效分離能力對(duì)分析物進(jìn)行分離，再以質(zhì)譜為檢測(cè)器使待測(cè)化合物產(chǎn)生氣態(tài)離子，再按m/z將離子分離，檢測(cè)。UPLC-UV-MS能充分發(fā)揮色譜的分離能力，并具有質(zhì)譜的高分辨特性，可得到保留時(shí)間、紫外響應(yīng)、荷質(zhì)比響應(yīng)這樣的三維信息，適合分析中藥多組分復(fù)雜體系。本實(shí)驗(yàn)選取木蝴蝶配方顆粒中黃酮類指標(biāo)性的代表成分白楊素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黃芩素、黃芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B 6種成分，以超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)為監(jiān)測(cè)平臺(tái)，利用多反應(yīng)選擇性檢測(cè)(MRM)的方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法快速、準(zhǔn)確、抗干擾力強(qiáng)，建立快速可靠的定量檢測(cè)方法，通過特征圖譜為全面有效控制木蝴蝶配方顆粒的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

Waters 液質(zhì)聯(lián)用儀(液相部分ACQUITY UPLC H-Class、質(zhì)譜部分Waters Xevo TQD MS)；百萬分之一天平(METTLER TOLEDO，XP26)；萬分之一天平(METTLER TOLEDO，ME204E)；電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，HWS-28)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ500DE)；超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司，Milli-Q-Direct)。

1.2 試藥

白楊素對(duì)照品(批號(hào)：111701-200501，純度：100%)、木蝴蝶苷B對(duì)照品(批號(hào)：111915-201603，純度：91.9%)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201720，純度：93.5%)、黃芩素對(duì)照品(批號(hào)：111595-201607，純度：98.5%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品(批號(hào)：wkq17072702，純度：98%)購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；木蝴蝶苷A對(duì)照品(批號(hào)：17021703，純度：98%)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈(德國(guó)merck公司，色譜純)；乙醇、甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司，分析純)；磷酸、甲酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；水為實(shí)驗(yàn)室自制水。

16批木蝴蝶配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，均來自供應(yīng)商，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量部檢測(cè)均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》木蝴蝶項(xiàng)下要求。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；流速為0.28 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.01%甲酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；柱溫為30 ℃；流速為0.28 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。

電噴霧離子源(ESI+)，噴霧電壓為1.55 kV；脫溶劑溫度為597 ℃，離子源溫度為148 ℃；脫溶劑氣流為997 L·hr-1；氮?dú)饬鳛? L·hr-1。質(zhì)譜掃描采用多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)掃描模式。Cone參數(shù)和Collision質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化通過蠕動(dòng)針泵注射的方法調(diào)諧各標(biāo)準(zhǔn)化合物。所得參數(shù)見表1，最終得到的液相紫外圖譜和質(zhì)譜提取離子流圖分別見圖1～2。

表1 LC-MS檢測(cè)木蝴蝶配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

注：*定量離子。

注：A.對(duì)照品；B.木蝴蝶配方顆粒。圖1 對(duì)照品和木蝴蝶配方顆粒色譜圖

注：A.木蝴蝶苷B；B.黃芩苷；C.木蝴蝶苷A；D.白楊素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷；E.黃芩素；F.白楊素。圖2 木蝴蝶配方顆粒供試品總離子流圖

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B對(duì)照品適量，加甲醇溶解定容至25 mL，即得白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B質(zhì)量濃度分別為12.594、69.600、32.286、128.256、31.512、60.276 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存，備用。

2.4 供試品溶液制備

取木蝴蝶配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：300 W，頻率：40 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

3 含量測(cè)定結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成含白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B質(zhì)量濃度分別為6.297、34.800、16.143、64.128、15.756、30.138 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，考察精密度，峰面積RSD見表2，結(jié)果RSD<3%，表明儀器精密度良好。

3.1.2線性關(guān)系 精密量取混合對(duì)照品溶液，按稀釋倍數(shù)為1、1.2、1.5、2、3、6依次逐級(jí)稀釋，定容，制得6個(gè)濃度梯度的系列混合對(duì)照品溶液，按照2.2中的質(zhì)譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各成分回歸方程、r、線性范圍，見表3，結(jié)果顯示6個(gè)成分的線性關(guān)系良好。

3.1.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批木蝴蝶配方顆粒(批號(hào)：8016072)，按照供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按照上述色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行平行測(cè)定，測(cè)得白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B的含量及相應(yīng)的RSD，見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本方法重復(fù)性良好。

3.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，峰面積RSD見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.5加樣回收率 精密稱取已知含量的木蝴蝶配方顆粒(批號(hào)：8016072)共6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按照2.4中供試品溶液的制備方法及2.2中的質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B的回收率，見表2，結(jié)果表明加樣回收率良好。

3.1.6含量測(cè)定 按照2.4中供試品溶液的制備方法及2.2中的質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算木蝴蝶配方顆粒中的白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷和木蝴蝶苷B 6種成分的含量，結(jié)果見表4。

表2 木蝴蝶配方顆粒方法學(xué)考察結(jié)果匯總

表3 木蝴蝶配方顆粒中6個(gè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

表4 16批木蝴蝶配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果(n=2) mg·g-1

4 特征圖譜測(cè)定結(jié)果

4.1 方法學(xué)考察

4.1.1精密度試驗(yàn) 取含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液，進(jìn)樣6次，每次1 μL，比較不同色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，分別為0.06%～0.09%、0.10%～0.37%。結(jié)果表明該方法精密度好，符合特征圖譜檢測(cè)要求。

4.1.2重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批木蝴蝶配方顆粒(批號(hào)：8016072)，按照供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL，比較不同色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，分別為0.08%～0.10%、0.03%～1.99%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，符合特征圖譜檢測(cè)要求。

4.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣1 μL，比較不同色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，分別為0.10%～0.16%、0.04%～1.32%。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性好，符合特征圖譜檢測(cè)要求。

4.1.4特征圖譜峰指認(rèn) 精密吸取白楊素、黃芩素、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黃芩苷、木蝴蝶苷B混合對(duì)照品溶液，上述色譜條件下進(jìn)樣，得木蝴蝶配方顆粒對(duì)照?qǐng)D譜，見圖3。

4.1.5特征圖譜建立與特征峰 取16批木蝴蝶配方顆粒樣品，按照2.4項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣1 μL，測(cè)定得色譜圖(見圖4)。將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，與其他樣品的色譜圖自動(dòng)匹配，生成木蝴蝶配方顆粒特征圖譜(見圖5)。分別計(jì)算16批木蝴蝶配方顆粒樣品的相似度，見表5，16批木蝴蝶配方顆粒相似度均大于0.90，說明木蝴蝶配方顆粒化學(xué)成分一致性較好，質(zhì)量比較穩(wěn)定。

圖3 木蝴蝶配方顆粒UPLC對(duì)照?qǐng)D譜

圖4 16批木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜

注：1.木蝴蝶苷B；2.黃芩苷；3.木蝴蝶苷A；4.白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；5.黃芩素；6.白楊素。圖5 木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜共有模式圖

表5 16批木蝴蝶配方顆粒相似度

序號(hào)相似度序號(hào)相似度10.99790.99920.998100.99930.999110.99940.998120.99850.998130.99360.999140.99970.998150.99981.000160.997

以1號(hào)峰為參照峰，標(biāo)示出木蝴蝶配方顆粒超高效液相紫外色譜圖中的6個(gè)共有峰，共有峰的峰面積之和>90%。計(jì)算各色譜峰與參照峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD。結(jié)果表明，樣品各色譜圖共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<3.0%；而相對(duì)峰面積的RSD相差較大，見表6～7。

表6 16批木蝴蝶特征圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表7 16批木蝴蝶特征圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

5 討論

文獻(xiàn)分析研究顯示[18]，木蝴蝶藥材中主要含有的黃酮類成分有白楊素、木蝴蝶苷B、黃芩素、黃芩苷、木蝴蝶苷A、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等黃酮類成分及多種黃酮苷元。本研究對(duì)木蝴蝶配方顆粒中黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行研究，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、相關(guān)文獻(xiàn)、對(duì)照品色譜保留時(shí)間及二級(jí)譜圖，得到標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜參數(shù)，建立木蝴蝶配方顆粒中化學(xué)成分含量的快速檢測(cè)方法，并建立木蝴蝶配方顆粒特征圖譜；與木蝴蝶藥材研究文獻(xiàn)相比，所建立的方法能更多地檢測(cè)木蝴蝶配方顆粒中的黃酮類指標(biāo)，且快速有效檢測(cè)化學(xué)成分含量，通過特征圖譜能對(duì)性狀完全改變后的木蝴蝶快速鑒別，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)方法和化學(xué)成分的深入研究提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)不同提取溶劑、不同提取方式、不同提取時(shí)間及不同料液比進(jìn)行考察，以色譜峰信息量最大化、提取效率最高、方法穩(wěn)定作為指標(biāo)，最終確定以70%乙醇作為提取溶劑，超聲處理(功率：300 W，頻率：40 kHz)30 min，0.1∶50料液比作為樣品的制備方法；對(duì)色譜條件中的色譜柱進(jìn)行考察，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，Agilent SB C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)柱分離效果最好，峰形更好；特征圖譜研究過程采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在276 nm處基線穩(wěn)定，各峰峰面積較高，因此，檢測(cè)波長(zhǎng)定為276 nm；對(duì)流動(dòng)相中水相進(jìn)行考察，通過對(duì)比乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%乙酸、乙腈-%甲酸及不同酸濃度對(duì)各色譜峰的影響，結(jié)果使用乙腈-0.1%磷酸各色譜峰分離效果最好，因質(zhì)譜不能使用有機(jī)鹽流動(dòng)相，改用0.01%甲酸為水相后各色譜峰分離效果一致，通過耐用性考察發(fā)現(xiàn)，柱溫和流速微小的變動(dòng)能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

本實(shí)驗(yàn)建立了木蝴蝶配方顆粒UPLC特征圖譜方法，確定并指認(rèn)了6各特征峰，較為全面地反映木蝴蝶黃酮類成分的特點(diǎn)。本研究與目前研究文獻(xiàn)相比[19-20]：同樣的分析時(shí)間條件下各色譜峰分離效果較好，且峰數(shù)較多；同樣的分離效果條件下，有分析時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)。目前暫沒有對(duì)木蝴蝶配方顆粒特征圖譜的研究，本研究為今后木蝴蝶配方顆粒的研究提供參考。

中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用符合炮制規(guī)范的飲片為原料，以水作為提取溶媒，經(jīng)過提取、過濾、濃縮、干燥、制粒等現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝制備得到的供臨床配方使用的顆粒制劑。其作為傳統(tǒng)飲片有效替代，供臨床辨證論治、隨證加減、配方使用，與傳統(tǒng)中藥飲片相比，中藥配方顆粒既保留了原中藥飲片的藥性、藥味和藥效，又具有不需煎煮、療效確切、安全方便等優(yōu)點(diǎn)，是“源于飲片，高于飲片”的現(xiàn)代中藥新型湯劑。早于1993年，在國(guó)家科委、國(guó)家中醫(yī)藥管理局的帶領(lǐng)下正式開展中藥飲片劑型的改革，開始中藥配方顆粒的研發(fā)和試點(diǎn)生產(chǎn)。2001年國(guó)家藥監(jiān)局頒發(fā)國(guó)家藥監(jiān)注〔2001〕325號(hào)文：“中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定”，并先后發(fā)文批準(zhǔn)了6家企業(yè)為中藥配方顆粒試點(diǎn)生產(chǎn)單位。但目前暫未對(duì)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明，本研究通過對(duì)木蝴蝶配方顆粒的質(zhì)量研究，為木蝴蝶配方顆粒后續(xù)研究提供技術(shù)支持。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)木蝴蝶配方顆粒黃酮類6種主要化學(xué)成分進(jìn)行了快速定性及定量分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各批次間含量有一定的差異，由于藥材受到產(chǎn)地、采收期及儲(chǔ)存條件等因素影響，同時(shí)，生產(chǎn)工藝控制點(diǎn)及控制量的差異，也會(huì)造成產(chǎn)品含量的差異，因此，應(yīng)嚴(yán)格控制原藥材的質(zhì)量，按照工藝規(guī)定操作控制，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可控，以保證藥品安全、有效。