金蕎麥種子質(zhì)量檢驗方法△

李進瞳，靳云西，林暉才，曾燕，矣健玲，焦連魁，李向東，王繼永，*

1.國藥種業(yè)有限公司，北京 100035；2.中國中藥有限公司，北京 100035

金蕎麥為蓼科蕎麥屬植物金蕎麥Fagophyrumdibotrys(D.Don) Hara的干燥根莖，氣微，味微澀；具有清熱解毒、清肺排痰、排膿消腫、祛風化濕之功效，用于肺膿瘍、麻疹肺炎、扁桃體周圍膿腫等癥[1-2]。現(xiàn)代藥理研究表明，金蕎麥在抗菌消炎、抗氧化、降血脂、抗癌、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移及增強免疫力等方面具有明顯的藥理活性[3-4]。金蕎麥分布于我國黃河以南的多個省區(qū)，主要以云南、貴州、四川3省野生資源最為集中，其繁殖方式主要為有性繁殖和無性繁殖[5]。目前，金蕎麥生產(chǎn)主要以無性繁殖為主，生產(chǎn)上存在種植后繁殖材料腐爛、易發(fā)病及種源退化減產(chǎn)等問題，對金蕎麥的研究多數(shù)在其藥理作用和化學成分等方面，有關(guān)金蕎麥種子質(zhì)量檢驗方法的研究尚未見報道。因此，本研究對金蕎麥種子的千粒質(zhì)量、生活力、含水量及發(fā)芽條件等進行了系統(tǒng)的研究，以期為金蕎麥種子檢驗規(guī)程和質(zhì)量分級標準的制定提供科學依據(jù)，為金蕎麥種苗培育及規(guī)范化栽培提供保障。

1 材料

試驗材料為2015年12月分別在云南昆明(Y)、重慶黔江(C)收集的金蕎麥種子，并于2016年3月開展方法學試驗研究。經(jīng)中國中藥有限公司王繼永研究員鑒定為金蕎麥Fagophyrumdibotrys(D.Don) Hara的種子。

赤霉素(生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；聚乙二醇-6000(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。FA2004B分析天平(上海實驗儀器有限公司)；D101電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司)；GTOP-Y智能光照培養(yǎng)箱(浙江托普云農(nóng)科技有限公司)；AS3120型超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

2 方法

2.1 扦樣

參考GB/T 3543.2—1995“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程—扦樣”執(zhí)行，確定金蕎麥種子批的最大質(zhì)量和樣品最小質(zhì)量。

2.2 凈度分析

按GB/T 3543.3—1995“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程—凈度分析”執(zhí)行。將扦樣得到的樣品用篩選法，即用《中華人民共和國藥典》1號篩(孔徑10 mm)，篩除種子中的其他種子、灰塵、土塊、殘枝敗葉、蟲卵等雜質(zhì)，再利用風選法，篩除未成形的種子和花序，計算種子凈度，重復3次。

2.3 質(zhì)量測定

將純凈的金蕎麥種子用四分法分成4份，分別采用百粒法、五百粒法、千粒法測定金蕎麥種子的千粒質(zhì)量。1)百粒法：從混合均勻的凈種子中隨機取樣8個重復，每重復100粒，各重復稱質(zhì)量，計算8個重復的平均值、標準差及變異系數(shù)。2)五百粒法：從混合均勻的凈種子中隨機取樣4個重復，每個重復500粒，各重復稱質(zhì)量，計算4個重復的平均值、標準差及變異系數(shù)。3)千粒法：從混合均勻的凈種子中隨機取樣3個重復，每個重復1000粒，各重復稱質(zhì)量，計算3個重復的平均值、標準差及變異系數(shù)。

2.4 真實性鑒定

采用種子外觀形態(tài)鑒定方法，隨機數(shù)取100粒種子，3次重復，用解剖鏡和顯微鏡逐粒觀察金蕎麥種子的形態(tài)特征并進行記錄。

2.5 含水量測定

取金蕎麥凈種子，參照GB/T 3543.6—1995“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程—水分測定”中苦蕎的測定方法，即分別取研磨后的種子5.0 g(50%過0.5 mm篩)，用低恒溫烘干法(103±2)℃測定。設(shè)置1、2、3、4、5、6、7、8 h，每小時稱定質(zhì)量1次，至恒重，計算種子含水量，重復4次。

2.6 發(fā)芽率測定

2.6.1種子發(fā)芽前處理方法 1)超聲波處理：采用AS3120型超聲波儀，40 kHz處理60 min，于自來水中浸種；2)GA3處理：將種子在100 mg·L-1GA3溶液中浸種；3)20%PEG-6000溶液浸種；4)以自來水浸種為對照；以上4種處理的浸種時間均為24 h；處理中的每項處理150粒種子，分3次重復，每個重復50粒種子[6-10]。

2.6.2發(fā)芽床的選擇 用GA3處理方法處理種子，在25 ℃下，設(shè)置沙、沙土(沙∶土=3∶1)、濾紙、褶皺紙、棉花5種不同發(fā)芽床，確定最佳發(fā)芽床；選擇2份不同產(chǎn)地樣品，每個試驗設(shè)置3次重復，每個重復50粒種子。

2.6.3發(fā)芽溫度和不同種子處理方法的選擇 用不同的種子處理方法處理種子，分別設(shè)置發(fā)芽溫度為15、20、25、30、35、40 ℃ 6個溫度；置于確定的最佳發(fā)芽床上；選擇2份不同產(chǎn)地樣品，每個試驗設(shè)置3個重復，每個重復50粒種子。

2.6.4培養(yǎng) 所有處理均依據(jù)GB/T 3543.4—1995“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程—發(fā)芽試驗”中苦蕎的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，光照12 h，光強為25 000 lx，培養(yǎng)16 d，統(tǒng)計發(fā)芽率。

2.6.5發(fā)芽計數(shù)時間的確定 根據(jù)種子發(fā)芽的情況，確定初次和末次計數(shù)時間。種子萌發(fā)以胚根突破種皮1 cm為初次計數(shù)時間，以種子萌發(fā)數(shù)達到最高且以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時的天數(shù)為末次計數(shù)時間。

2.7 生活力測定

采用TTC法測定金蕎麥種子生活力。種子經(jīng)蒸餾水浸泡12 h，沿種子垂直腹縫線縱切去2/5，對照為煮死種子。分別設(shè)置1、2、3、4、5 h的5個不同染色時間；設(shè)置30、35、40、45 ℃的4個不同染色溫度；設(shè)置0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%的6個不同TTC濃度，確定TTC染色法的最佳染色條件。每個處理3次重復，每個重復用100粒種子(200個半粒)，胚及子葉全部染成紅色為有生活力的種子。

3 結(jié)果

3.1 扦樣

采用徒手減半法扦取試驗樣品，種子批的最大量為2000 kg，送檢樣品最少量為1000 g，按GB/T 3543.3—1995規(guī)定，最小試樣量應大于2500粒種子，凈度分析試驗量最少為100 g。

3.2 凈度分析

試驗樣品為不同產(chǎn)地的2份金蕎麥種子。2份樣品中均不存在其他植物種子，由雜質(zhì)和凈種子組成，雜質(zhì)為土塊、殘枝敗葉、花萼、花瓣等。采用此方法做的凈度分析，各樣品重復間種子質(zhì)量差距均沒有偏離原始質(zhì)量的5%，因此該方法和程序切實可行，見表1。

表1 不同產(chǎn)地金蕎麥種子凈度

3.3 質(zhì)量測定

采用3種方法對不同產(chǎn)地的2份金蕎麥種子的質(zhì)量進行了測定。不同產(chǎn)地的2份種子千粒法的變異系數(shù)均>4%，其中變異系數(shù)最小的是五百粒法，由于金蕎麥種子屬于大粒種子，質(zhì)量中等，因此，采用五百粒法測定其質(zhì)量較為科學，見表2。

表2 不同產(chǎn)地金蕎麥種子質(zhì)量測定結(jié)果

3.4 真實性鑒定

金蕎麥成熟種子為瘦果卵狀三棱錐形，黑褐色或紅棕色，大小為(6.5～7.4) mm×(4.9～5.3) mm。花被宿存。下部膨大，上部漸狹，具三棱脊，表面粗糙無光澤；顯微鏡下可觀察到種子表面紋飾，皺紋網(wǎng)狀，網(wǎng)眼圓形至方形，網(wǎng)脊具粗條紋[2，11]。不同主產(chǎn)地種子形態(tài)見圖1。

圖1 不同產(chǎn)地金蕎麥種子形態(tài)

3.5 含水量測定

取2份不同產(chǎn)地的樣品，各3個重復，在8 h內(nèi)每小時測定其含水量，計算平均值的結(jié)果見圖2，從圖2可以看出，來自云南的樣品含水量在烘6 h后為9.76%、7 h后為9.78%、8 h后為9.81%；來自重慶的樣品含水量烘6 h后為9.77%、7 h后為9.74%、8 h后為9.79%；可以看出烘干6 h后，2個不同產(chǎn)地樣品的水分含量均趨于穩(wěn)定，故選定6 h為金蕎麥種子含水量測定的時間。

圖2 金蕎麥種子不同測定時間的含水量

3.6 發(fā)芽率測定

3.6.1發(fā)芽床的確定 設(shè)置5種不同的發(fā)芽床進行金蕎麥種子的發(fā)芽試驗，置于濾紙床上的種子發(fā)芽率最高，明顯高于其余4種發(fā)芽床，棉花床的發(fā)芽率次之，褶皺紙床發(fā)芽率最低，因此，金蕎麥種子發(fā)芽的最佳發(fā)芽床為濾紙床。不同產(chǎn)地的2份樣品在5種不同發(fā)芽床上的發(fā)芽率統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 5種不同發(fā)芽床發(fā)芽率統(tǒng)計結(jié)果

3.6.2種子前處理及發(fā)芽溫度的確定 用3種不同的種子前處理方法，在6個不同溫度下的金蕎麥種子發(fā)芽率不同，2個不同產(chǎn)地的金蕎麥種子在溫度高于40 ℃時，均不萌發(fā)，表現(xiàn)為種子膨大，種皮軟腐，失綠，多數(shù)未見子葉，胚根萌發(fā)后干枯。3種前處理方式除超聲處理外，其余2種均明顯高于對照組，GA3處理組最佳；在GA3處理組中，6個不同溫度下2個不同產(chǎn)地的金蕎麥種子發(fā)芽率在20～30 ℃較高，這與苦蕎種子發(fā)芽率規(guī)律一致，其中在25 ℃下金蕎麥種子發(fā)芽率最佳，確定金蕎麥種子發(fā)芽前處理為GA3處理，發(fā)芽溫度為25 ℃，這與王宏信等[9]的研究結(jié)果一致。不同產(chǎn)地金蕎麥種子不同前處理及不同發(fā)芽溫度下種子發(fā)芽率統(tǒng)計結(jié)果見表4。

3.6.3發(fā)芽計數(shù)時間的確定 從胚根突破種皮1 cm開始，每24 h記錄1次發(fā)芽率，共記錄16 d，2個不同產(chǎn)地的金蕎麥種子均于第2天開始萌發(fā)，發(fā)芽率分別為重慶2%、云南5%，第4～9天發(fā)芽種子數(shù)量逐漸增多，第9天后，來自于重慶的樣品發(fā)芽率分別為70%(9 d)、75%(10 d)、77%(11 d)、77%(12 d)、77%(13～16 d)；來自于云南的樣品發(fā)芽率分別為69%(9 d)、73%(10 d)、74%(11 d)、75%(12 d)、75%(13～16 d)。可以看出，第12天后，2個不同產(chǎn)地的種子均沒有新的萌發(fā)。因此，確定金蕎麥種子發(fā)芽計數(shù)時間為第2～12天，即第2天為初次發(fā)芽計數(shù)時間，第12天為末次發(fā)芽計數(shù)時間，見圖3。

3.7 生活力測定

在不同的染色溫度(30、35、40、45 ℃)條件下，以不同濃度(0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%)TTC在不同時間(1、2、3、4、5 h)進行染色，發(fā)現(xiàn)TTC濃度為0.5%，染色時間為 2 h，染色溫度為35 ℃時的金蕎麥種子染色情況最好，染色時間短，染色效果好，顏色均勻，見表5。

表4 不同溫度、不同處理下金蕎麥種子發(fā)芽率 統(tǒng)計結(jié)果

圖3 金蕎麥種子不同計數(shù)時間的發(fā)芽率

金蕎麥種子用TTC染色法染色后的效果見圖4。有活力的種子：胚和子葉全部均染色；子葉遠胚根一端≤1/3不染色，其余部分完全染色；子葉側(cè)邊總面積≤1/3不染色，其余部分完全染色。無生活力種子：胚和子葉完全不染色；子葉近胚根處不染色；胚根不染色；胚和子葉染色不均勻，其上有斑點狀不染色；子葉不染色面積>1/2；胚所染顏色異常，且組織軟腐。

4 討論

金蕎麥藥材一直依賴于野生資源的采集，其藥材質(zhì)量參差不齊，隨著市場需求的增長和藥材質(zhì)量的日益高要求，越來越多的制藥企業(yè)關(guān)注并進行了金蕎麥的人工種植。近年來，金蕎麥的種植面積和區(qū)域不斷擴大，因此，建立金蕎麥種子的質(zhì)量檢驗方法，制定相應的金蕎麥種子檢驗規(guī)程和質(zhì)量分級標準，對實現(xiàn)金蕎麥規(guī)范化種植具有重要意義。

在采收金蕎麥種子的過程中，由于種子的落粒性較強，容易混有雜草的種子和土塊，因此在進行凈度分析時，應選用篩選法，篩除雜質(zhì)和土塊；另外，金蕎麥花序為無限花序，在種子采收過程中，下部花序種子已經(jīng)成熟，上部花序未形成種子和正在凋謝的較多，因此在進行凈度分析時，篩除雜質(zhì)和土塊后應再進行風選，以篩除未成形的種子和凋謝的花序。

表5 在不同溫度、不同TTC濃度不同染色時間 對金蕎麥種子的染色效果

金蕎麥種子生活力的檢測方法有效可行，不同產(chǎn)地生活力與發(fā)芽率趨勢一致，但在試驗中發(fā)現(xiàn)同一個樣品的生活力和發(fā)芽率檢測值差異較大，超過了10%，這可能與金蕎麥的種皮厚度和胚乳發(fā)育有關(guān)，具體原因還有待進一步研究。

圖4 金蕎麥種子TTC法染色效果