基于科研成果的藥理學教學實驗探索

蔣 敏,李 會,史勁松

(江南大學 藥學院， 江蘇 無錫 214000)

0 引 言

藥理學實驗是藥學專業實驗課的重要組成部分，其旨在培養學生動手、觀察和解決問題的能力[1]。目前單一的驗證性實驗依舊是各校采用的一種教學模式，這一傳統模式并不利于培養創新性應用型藥學人才，與我國醫藥事業快速發展的需求不相匹配，因此，各大院校均致力于大力增加設計性實驗課程占比，將傳統的驗證性實驗轉變為設計性實驗，旨在調動學生學習積極性，提高應用知識、分析解決問題的能力[2]。

隨著人們生活水平的日益提高，酒精性肝損傷已成為世界各國共同面臨的健康問題，因此研制出能夠預防和治療急性酒精性肝損傷的解酒食品、藥品有著重要的臨床意義。我校制藥工程專業擁有一支高水平的師資隊伍和優良的硬件條件，近些年積極開展藥理學實驗教學改革，推進設計性實驗教學工作。本設計性實驗依托于學院科研成果，選擇與生活實際密切相關的解酒保肝為切入點，建立小鼠中、高劑量飲酒模型，對前期研究成果-文蛤酶解反應深加工產品進行評價，通過實驗學生一方面可直接從小鼠的行為學觀察到解酒效果，還可通過生化、組織病理學等檢測手段從技術角度輔證解酒保肝效果。本綜合性實驗由學生自由建組，在老師指導下完成實驗設計與方案，小組內分工合作完成任務，以期提高學生的綜合處理問題能力。

1 實驗原理

文蛤，是我國重要的海洋貝類之一，其肉鮮，營養豐富，富含人體必需的氨基酸、礦物質等，現代藥理學研究表明文蛤及其酶解物在抗腫瘤、保肝臟、提高免疫等方面均表現出一定的功效。文蛤酶解產物是本院科研組較為成熟的科研成果，該酶解物整體風味良好，富含具有抗氧化[3-4]、保肝護肝[5]的活性多肽(21.8 g/L)、游離氨基酸(?；撬帷⒈彼?、谷氨酸等，4.15 g/L)等[6]活性物質，可明顯對抗醉酒第二階段的共濟失調現象[7]，延長小鼠在轉棒疲勞儀上的停留時間，還能明顯延長小鼠醉酒耐受期，縮短小鼠醉酒睡眠時間，同時減少因急性酒精中毒引起的肝臟損傷。

2 試劑及儀器

試劑及溶劑：紅星二鍋頭(56°)，谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，一氧化氮(NO)試劑盒均采購于南京建成海浩生物科技有限公司；文蛤酶解產物按照文獻[6]中方法制備，即取文蛤肉，加水勻漿，加熱至50°C，再依次添加75 u/g中性蛋白酶、75 u/g復合蛋白酶進行二段酶解，酶解溫度為45°C，水解3 h，隨后加入50 u/g風味蛋白酶，50°C酶解1 h，離心取上清，噴霧干燥，即得。實驗前將其配置成0.1 g/mL溶液，待用。

實驗動物：昆明種雄性小鼠(體重25～30 g，購于上海斯萊克實驗動物責任有限公司),動物飼養溫度(23±2)°C，相對濕度(50±5)%，自由進食和飲水。

儀器：轉棒儀；全自動生化分析儀；石蠟切片儀；低溫高速離心機；紫外分光光度計；電子天平。

3 操作方法

3.1 評價文蛤酶解產物對中劑量飲酒引起小鼠平衡失調的緩減作用

參考文獻[8]方法，取20只小鼠，本實驗環境下適應喂養1周，禁食12 h后，隨機分成2組，每組10只，分別為模型組、實驗組，模型組先按照體重灌胃8 mL/kg的生理鹽水，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，實驗組先按體重灌胃8 mL/kg的文蛤酶解產物，30 min后灌胃8 mL/kg白酒，記錄給藥時間、給酒時間。灌胃結束后分別在30、60、90 min時將小鼠放入疲勞儀轉棒上，將疲勞儀轉速設置為20 r/min，記錄小鼠在棒停留時間。

3.2 評價文蛤酶解產物對高劑量飲酒引起小鼠急性肝損傷的保護作用

3.2.1 實驗分組與給藥

取30只小鼠，本實驗環境下適應喂養1周，隨機分成3組，每組各10只，分別為正常組、模型組和實驗組，取模型組和實驗組兩組小鼠按照以下方法灌胃：模型組：8 mL/kg的生理鹽水，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒；實驗組：灌胃8 mL/kg的文蛤酶解產物，30 min后灌胃13 mL/kg的白酒，記錄時間。

3.2.2 翻正反射觀察

灌服白酒后隨機觀察小鼠活動情況。以小鼠爬行不穩、閉眼懶動、后腹拖地為醉酒指標，以行動靈活、精神恢復為醒酒指標，記錄小鼠醉酒時間和醒酒時間，計算小鼠醉酒潛伏期(從灌酒至醉酒的時間)和醉酒持續時間(從醉酒至醒酒的時間)[9-10]。

3.2.3 生化指標檢測與病理學觀察

參照文獻[11]方法，末次給酒12 h后取正常組、模型組和實驗組3組小鼠摘眼球取血，斷脊椎處死小鼠。血液離心(4 000 r/min)后分離血清，全自動生化分析儀檢測ALT 與AST水平。

摘取肝臟，取肝臟同一部位，生理鹽水反復沖洗，濾紙吸干后，準確稱取組織重量，按重量體積比1∶9的比例加入生理鹽水，制成10%(w/v)的組織勻漿，低溫離心10 min(3 000 r/min)，取上清液按照試劑盒操作說明檢測SOD、MDA、NO。同時取肝臟固定部位組織存放于10%中性福爾馬林液中固定24 h后轉移至75%乙醇，脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學變化。

3.2.4 數據處理

所有數據均采用mean±SD表示。所有數據采用GraphPad Prism 5統計軟件進行One-way ANOVA分析，組間比較用t-test法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

4 實驗結果

4.1 文蛤酶解產物對中劑量飲酒引起小鼠平衡失調的緩減作用

不同組小鼠在疲勞儀上的停留時間如圖1所示。由該圖可見，在30、60、90 min時模型組小鼠在轉棒上的停留時間均在4 s以內，且不隨時間的延長而變化，說明在90 min內小鼠仍舊處于醉酒狀態。而與模型組相比，實驗組小鼠在疲勞儀上的停留時間明顯延長，并且隨著時間的延長而顯著增加，當90 min時，實驗組的小鼠的停留時間是模型的4倍。實驗結果提示文蛤酶解產物能顯著緩解酒精引起的小鼠運動失調。

圖1 不同組小鼠疲勞儀停留時間(*：p<0.05)

4.2 文蛤酶解產物對高劑量飲酒引起小鼠急性肝損傷的保護作用

4.2.1 醉酒潛伏期和醉酒持續時間

不同組小鼠飲酒后醉酒潛伏期與醉酒持續時間如圖2所示。由圖可見，模型組小鼠醉酒潛伏期為20 min，而實驗組小鼠的潛伏期是模型組小鼠的兩倍，顯著高于模型組(p<0.05)。模型組小鼠的醉酒持續時間長達160 min，而實驗組小鼠醉酒時間是模型組的63%，顯著低于模型組(p<0.05)。結果提示，文蛤酶解產物具有顯著的防醉解酒效果。

圖2 不同組小鼠醉酒潛伏期和醉酒持續時間(*：p<0.05)

4.2.2 血液指標

ALT、AST是醫學臨床上常用用的評價肝臟功能的兩個重要肝功能酶。正常情況下，血清中ALT與AST含量極少，當肝臟組織受損導致肝細胞遭到大量破壞后，肝細胞中的ALT、AST釋放入血清，導致血清中ALT、AST活性明顯增強[12]。

不同組小鼠血清中AST與ALT檢測結果如表1所示。與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清中ALT、AST明顯升高(p<0.05)，說明高劑量飲酒會直接造成肝細胞受損，這與文獻報道相一致[13]。實驗組小鼠的ALT以及AST與模型組相比均顯著下降，說明文蛤酶解產物能夠預防酒精對肝臟組織的損傷(p<0.05)。

表1 不同組小鼠血清中AST與ALT的比較

注：a表示與正常組有顯著性差異；b表示與模型組有顯著性差異，p<0.05

4.2.3 肝臟組織指標

酒精經腸道吸收后，在肝臟經乙醇脫氫酶和非乙醇脫氫酶系統代謝后形成大量自由基和MDA等一系列脂質氧化代謝物。SOD是肝臟中一種重要的抗氧化酶，能清除自由基和過氧化物，防止對細胞和機體的損傷[14]。因此，肝臟損傷越嚴重，肝組織中MDA含量就越高，SOD水平下降就越明顯。與先前研究結果相一致[15]，在酒精性肝損傷模型小鼠中，MDA含量顯著高于正常組(p<0.05)，SOD水平顯著降低(p<0.05)(見表2)，提示在氧化應激狀態下，小鼠肝細胞嚴重受損。而灌服文蛤酶解產物后，MDA水平顯著下降(p<0.05)，SOD水平顯著提高(p<0.05)，表明文蛤酶解產物對酒精引起的氧化反應具有很強的抑制作用，并能降低自由基積累。

表2 不同組小鼠肝組織勻漿中MDA、SOD、NO含量

注：a表示與正常組相比有顯著性差異(p<0.05)；b表示與模型組相比有顯著性差異(p<0.05)

正常情況下，NO在肝臟中發揮微循環功能調節信使，在肝臟中含量水平較低，但是在氧化應激狀態下，肝臟會應急性持續生成、釋放大量NO，而此時產生的大量NO是肝損傷炎癥的重要促進因子，對肝臟產生毒性作用，因此NO是肝細胞氧化應激的關鍵分子之一[16]。結果提示，模型組小鼠NO水平顯著高于正常組，而在飲酒前灌服文蛤酶解產物能夠抑制NO的生成(p<0.05)，說明文蛤酶解產物能夠預防酒精引起的氧化損傷。

4.2.4 肝臟組織病理切片

肝組織切片如圖3所示。正常組小鼠肝索排列整齊，肝組織結構正常，而模型組小鼠肝細胞排列紊亂，肝細胞中出現大小不一的脂肪空泡，這與文獻[17]報道相一致；實驗組小鼠肝細胞排列整齊，肝細胞無明顯的脂肪變性。

(a) 正常組

(b) 模型組

(c) 實驗組

5 結 語

(1) 結合疲勞儀與翻正反射實驗，可通過動物行為學直接觀察小鼠醉酒情況，實驗難度適中，實驗課時合理，有助于提高學生藥理學動物實驗基本操作技能。

(2) 生化分析技術與病理學切片技術已在藥理學科研領域得到全面普及，本綜合性實驗要求學生熟練掌握解剖、取血等技能以獲取血液、肝組織樣本，進行指標檢測及肝組織病理切片，對培養學生綜合實驗技能和科研素養有重要的意義。

(3) 實驗結束后合理引導學生利用專業數據處理軟件對不同組別數據進行計算分析，有助于培養學生建立數據分析觀念，提高數據分析能力。