貴州白山羊脂聯素基因（ADIPOQ）序列和表達分析

安清明，吳震洋，孟金柱，趙園園，樊軍德，田秀珍，王 星

（1.銅仁學院，貴州 銅仁 554300；2.華珍牧業有限公司，貴州 銅仁 554300）

貴州白山羊是中國著名的地方山羊品種，主要分布在黔東南、黔東北等地區，存欄量100多萬只，是發展貴州畜牧業的重要種質資源。脂聯素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪細胞分泌的唯一與脂肪含量負相關的細胞因子，相關文獻表明，ADIPOQ基因在脂肪代謝中起重要的調控作用[1]，脂聯素基因由3個外顯子和2個內含子組成，其主要編碼的脂聯素蛋白由信號肽、可變區、N-膠原蛋白三螺旋區域和C-球狀區域構成，能夠通過結合蛋白直接參與調解脂肪酸氧化和糖類攝取過程[2]。目前，研究發現ADIPOQ基因與人體的肥胖、胰島素耐受性和動脈粥樣硬化等疾病相關[3]，但在家畜動物研究中發現ADIPOQ基因遺傳變異對家畜動物的生產性狀具有一定的影響，如ADIPOQ基因變異可以影響豬的胴體性狀[4]，影響牛的眼肌面積、背標厚度[5]，影響綿羊的生長速度和胴體性狀等[6]。但在山羊中該基因的研究報道較少，僅發現954G/A變異可以影響山羊產羔數[7]。因此，本研究擬通過ADIPOQ基因的序列和表達分析，進一步增進貴州白山羊的遺傳多樣性和發育情況的了解，以期對貴州白山羊的合理利用提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的貴州白山羊血樣及組織樣均采自貴州省銅仁市德江縣高山鎮。采集的新鮮血樣和組織樣分別于-20℃和-80℃保存備用。

1.2 實驗儀器及試劑

Bio-Rad PCR儀，Bio-Rad 凝膠成像儀，高速低溫離心機，水平電泳儀，ABI實時熒光定量PCR儀，DNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，熒光定量試劑盒，PCR預混酶等。

1.3 PCR引物設計與合成

根據NCBI中綿羊ADIPOQ基因序列（NC_019458.2），利用Primer 5.0 設計特異性引物：F：GGATTCTGAACATCATTCATTC，R:CAGATGAGTTGGTGGGAGAC，用于ADIPOQ基因序列分析；設計特異性引物F：TACAAGAACGACAAGGCCCT，R：ACTTGGTCACCCTTCTCCAG用于組織特異性表達分析，其中熒光定量分析以GAPDH基因為內參基因，特異性引物為F: CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA，R:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 ADIPOQ基因部分序列PCR擴增及測定

PCR反應體系：DNA樣品1μl，Taq PCR預混酶11 μl，10 mmol·L-1上下游混合引物1 μl，加ddH2O至20μl。

PCR擴增程序：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個循環，延伸5 min，4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無特異性條帶后送生工生物工程（上海）測序。

1.5 遺傳多樣性數據處理

用MEGA5.0軟件對測序結果進行分析比對，通過NCBI數據庫查找相關物種序列，建立數據庫，用Lasergene7.0軟件對相關物種序列進行處理并建立系統發育樹。

1.6 ADIPOQ基因實時熒光定量分析

采用Trizol法提取貴州白山羊各組織（心、肝、脾、肺和腎）總RNA，經反轉錄合成cDNA，按照說RT-qPCR說明書指導配置反應體系并設定反應程序。采用RT-qPCR方法分析ADIPOQ基因在白山羊心、肝、脾、肺和腎中的表達特異性。熒光定量試驗設計3個重復，采用2-△△CT方法將數據進行均一化處理，計算相對表達量，最后利用Minitab16.0進行顯著性差異分析。

圖1 貴州白山羊ADIPOQ基因測序結果

2 結果

2.1 測序結果分析

已知引物擴增序列為455 bp，將檢測的DNA測序經Chromas軟件進行結果分析（圖1），結果顯示所用貴州白山羊樣品測定序列波峰信號單一，無其他雜亂信號干擾，預示測序結果準確，可用于后續的序列分析。

2.2 貴州白山羊ADIPOQ基因差異性對比結果分析

利用MEGA5.0程序對本研究中測得的貴州白山羊ADIPOQ基因序列與An等[6]發現的綿羊等位基因A和B進行序列比對，發現貴州白山羊與綿羊等位基因A和B共有8處核苷酸變異，分別為c.26 C/G、c.161 C/T、c.190 C/A、c.196 C/T、c.226 C/T、c.331 C/A、c.407 C/T和c.418 G/A變異，比對結果見圖2。

2.3 貴州白山羊ADIPOQ基因群體間遺傳特征

從NCBI數據庫中檢索其它6個不同物種ADIPOQ基因與本試驗檢測得到的貴州白山羊核苷酸序列根據領位相連法（Neighbor-joining，NJ法）構建系統進化樹（圖3），結果表明，貴州白山羊與綿羊遺傳距離最近，與牛和牦牛次之，而與豬、人類遺傳距離較遠，這一結果與這些物種在生物學上進化分類一致。

圖2 貴州白山羊與綿羊ADIPOQ基因核苷酸序列比對結果

圖3 不同物種ADIPOQ基因核苷酸序列構建的系統樹

2.4 貴州白山羊ADIPOQ基因在不同組織中的表達分析

利用實時熒光定量PCR對貴州白山羊心、肝、脾、肺和腎組織中的ADIPOQ基因編碼mRNA的相對表達量進行檢測，由圖4可知，ADIPOQ基因在肺組織中的表達量最高，其次是脾、心和肝，在腎中的表達量最低。

圖4 貴州白山羊ADIPOQ基因編碼mRNA表達分析

3 討論

通過測序結果比對分析，雖然在貴州白山羊樣本里沒有發現核苷酸變異，但與綿羊不同等位基因比對發現8處核苷酸變異位點，說明貴州白山羊與綿羊物種之間存在的種間差異，也可能是貴州白山羊樣品來源群體經過了世代選擇，使得白山羊群體間核苷酸變異減少，但該結果也表明，白山羊與綿羊之間仍具有核苷酸變異，且這用變異差距可能會影響到貴州白山羊的生產性狀，已有研究表明ADIPOQ基因核苷酸變異可以影響豬、牛和綿羊的生產性狀[4-7]。本研究基于遺傳距離聚類算法構建了貴州白山羊群體的聚類圖，通過與不同物種之間的聚類分析，推測了物種間的適應性進化，研究發現，貴州白山羊與綿羊間的遺傳距離最小，牛屬次之，這與物種的進化關系一致，且它們均屬于偶蹄目家畜，與其它物種間的進化距離較遠。

對貴州白山羊內臟器官進行ADIPOQ基因編碼mRNA表達量檢測，結果表明在所檢測器官中均有表達，但在肺臟中表達量最高，在腎臟中表達量最低，這與李雪梅等研究結果存在差異[8]，但與陳宇光等研究結果相似，結果均發現ADIOQ基因mRNA在腎臟組織中的表達量最低[9]。本研究對貴州白山羊ADIPOQ基因序列和蛋白進行了分析，分析結果有助于對ADPOQ基因序列變異和功能進行深入研究，也為進一步研究ADIPOQ基因對貴州白山羊生長性能和脂肪累積過程中的功能奠定了遺傳信息基礎。