慢病毒介導沉默CDH1基因的MDCK細胞株建立中最佳的MOI值及嘌呤霉素濃度的篩選

冶昡青，郭壽清，喬自林，劉振斌

（1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

流感（influenza）是由流感病毒（influenza virus）引起的一種可在禽類和哺乳動物間進行傳播的呼吸道傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球每年流感感染人數(shù)達到10億以上，25～50萬人感染致死。該病對社會經濟和人類的健康造成極大的威脅。

普遍認為，免疫接種是控制流感流行最為有效的措施。采用基于動物細胞的流感疫苗生產工藝，具有較高的安全性、有效性、低致敏性等優(yōu)勢。MDCK細胞系通常是以貼壁方式生長的上皮樣細胞，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細胞系被公認為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產的3種細胞系之一。但MDCK細胞貼壁性狀難以實現(xiàn)疫苗大規(guī)模生產，單細胞懸浮培養(yǎng)更適合流感爆發(fā)期疫苗的批量生產。常規(guī)的懸浮細胞馴化過程周期較長，培養(yǎng)成本較高，并且細胞多次傳代很可能降低細胞的活性和增值效率。

因此，利用基因工程的手段對MDCK細胞貼壁性相關基因進行改造，人工建立穩(wěn)定的具有懸浮性狀的MDCK細胞系，對于促進疫苗生產的產業(yè)化進程具有重要意義。CDH1基因是E-鈣黏蛋白(cadherin)的編碼基因，E-cadherin是鈣粘蛋白家族成員。研究發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白在很多上皮細胞的粘附功能中發(fā)揮著重要的作用，理論上當細胞的黏附能力降低或被抑制時，細胞就會向懸浮的狀態(tài)轉化，本研究試圖用分子生物學手段，通過慢病毒介導建立沉默CDH1基因的MDCK細胞株，驗證細胞貼壁性（懸浮性）的變化情況，在細胞株建立過程中，最佳的MOI值及嘌呤霉素濃度的測定尤為重要，直接決定著穩(wěn)轉細胞系構建的成敗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及病毒 CDH1干擾陰性對照慢病毒（病毒滴度：5×108TU/mL）（上海吉凱生物科技有限公司）；MDCK貼壁細胞系（ATCC，# CCL-34）

1.1.2 試劑與儀器 DMEM（蘭州百靈，#BGL M101.01）；胎牛血清（Cellmax，# SA311.01）；0.25% 胰酶（Cell Max，CPT101.02）；嘌呤霉素（blasticidin）；HitransGP試劑（上海吉凱）。

CO2培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-175型）；熒光顯微鏡（OLYMPUS，IX83）；生物安全柜（BAKER，BCG401）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染MDCK細胞的最佳MOI值測定取對數(shù)生長期的MDCK細胞，以1.5×104個/孔密度鋪板于96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)16 h，細胞密度達到80%～90%，以MOI值為0、10、50、100（TU number/cell）（每個MOI值設6個復孔）的熒光標記的CDH1干擾陰性對照慢病毒分別侵染MDCK細胞，同時加入HitransGP助染試劑，病毒侵染期間每4 h觀察細胞形態(tài)，細胞發(fā)生病變趨勢或明顯病變則換液為細胞完全培養(yǎng)基，細胞形態(tài)良好則病毒侵染24 h后換液為完全培養(yǎng)基，病毒感染細胞72 h后使用熒光顯微鏡觀察，熒光比率達到80%～90%且細胞形態(tài)基本不變，對應的MOI值確定為最佳MOI值。熒光比率=細胞熒光表達量/白光細胞總量×100%

1.2.2 嘌呤霉素最佳濃度的測定 取對數(shù)生長期的MDCK細胞，以1.5×104個/孔密度鋪板于96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)16 h，細胞密度達到80%～90%，向細胞中分別加入0～11μg/ml Puromycin，每1μg/ml設置一個濃度梯度，每個濃度梯度設置六個復孔，每24 h進行活細胞計數(shù)，計算活細胞比率，兩天換一次液，第4天細胞全部死亡的最低濃度確定為嘌呤霉素最佳濃度。

2 結果

2.1 慢病毒感染MDCK細胞的最佳MOI值測定結果

隨著MOI值的增加，細胞形態(tài)基本沒有改變，當MOI≤10時，熒光比率為0%，MOI=50時，熒光比率為40%～50%，當MOI=100時，細胞的熒光比率為80%～90%，此時細胞形態(tài)正常，MOI=100被確定為慢病毒感染MDCK細胞的最佳MOI值，見圖1。

圖1 不同MOI值下MDCK細胞熒光率鏡檢結果（×200）

2.2 嘌呤霉素的最佳濃度測定

加入Puromycin第四天，當Puromycin濃度為0μg/ml時，細胞存活率為95%，形態(tài)正常；當Puromycin濃度為6μg/ml時，細胞存活率為15%，大部分細胞形態(tài)變圓，失去貼壁性，該濃度Puromycin明顯抑制了細胞的增殖。當Puromycin≥7μg/ml時，MDCK細胞存活率為0%，細胞形態(tài)已全部變成圓形，細胞失去原有的貼壁性。因此7μg/ml被確定為Puromycin最佳濃度。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度Puromycin加入第四天細胞鏡檢結果（×100）

圖3 不同濃度Puromycin加入第四天MDCK細胞存活率結果

3 討論

在整個測定細胞最佳MOI值試驗設計中，需要增加一個空白對照，通過觀察完全培養(yǎng)基中添加HitransGP的細胞狀態(tài)，得知HitransGP對細胞有無影響。在慢病毒侵染細胞的前4～6 h，可適當減少細胞培養(yǎng)體積，從而增加病毒濃度，加快和增強病毒進入細胞，6 h左右酌情補液，24 h換成完全培養(yǎng)基即可，之后細胞培養(yǎng)過程中可以不再換液。若換液過于頻繁，可能會影響細胞生長狀態(tài)，不利于細胞最佳MOI值的結果判斷。通過試驗得知，當MOI值為100時，細胞的熒光率在80%～90%，細胞的死亡率較低，病毒的侵染效果最佳。

導入細胞的目的基因中載有特殊的抗性基因，產生的基因表達產物，使細胞對特定抗生素有抗性，空白細胞缺少抗性產物而被殺死，本實驗中慢病毒載體帶有抗Puromycin的抗性基因，在細胞培養(yǎng)基中加入一定濃度Puromycin時，不含抗性基因的MDCK空白細胞被殺死，含抗性基因的慢病毒載體導入細胞后表現(xiàn)為陽性細胞，陽性細胞能夠存活。Puromycin濃度過低會導致MDCK空白細胞無法全部殺死，影響最終感染效率，Puromycin濃度過高則造成陽性細胞表達下降，因此正式實驗前需要測定Puromycin最佳作用濃度。結果顯示加Puromycin第四天濃度為6μg/ml時，細胞存活率為15%，不能達到對空白細胞的理想殺滅效果，當Puromycin濃度≥7μg/ml時，細胞死亡率達100%，7μg/ml是第四天細胞全部死亡的最低濃度，故7μg/ml被確定為嘌呤霉素的最佳濃度。

經過對最佳的MOI值及嘌呤霉素濃度的篩選測定，為后續(xù)慢病毒介導沉默CDH1基因的MDCK細胞株的建立奠定了夯實的基礎。