金百麥環境改良劑對豬繁殖與呼吸綜合征病毒殺滅效果研究

柒葉荷 黃全奎 周松峰 白云華 賴平生 秦樹英 吳健敏*

（1.廣西里建桂寧種豬有限公司，廣西 南寧，530105；2.北京百凈保科技發展有限公司，北京，100093；3.南寧正大畜牧有限公司，廣西 南寧，530219；4.廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西 南寧，530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種在全球范圍內廣泛傳播的豬的重要病毒性傳染病，又稱豬藍耳病。其臨床癥狀主要表現為懷孕母豬早產、流產、產死胎和木乃伊胎等，仔豬和育肥豬會出現呼吸道癥狀，并伴隨有間歇性肺炎，病死率較高，是世界范圍內造成嚴重的豬繁殖與呼吸系統疾病的主要病因［1］。PRRSV主要在豬肺泡巨噬細胞（PAM）和樹突狀細胞（DC）中復制，該病目前無有效治療藥物，死亡率較高，嚴重影響全球養豬業發展，造成巨大經濟損失［2,3］。

疫苗一直是人們預防和控制PPRS的首選和重要工具，但在當前非洲豬瘟風險增加和養豬形勢嚴峻的情況下，殺毒劑的使用越來越受到人們的關注。金百麥環境改良劑（Genbiom）是一種全新的固態環境改良劑，主要成分為二氧化鈦［4］。它不僅可以降解環境中的污染物，還能夠起到殺滅病毒和細菌的作用［5］。本試驗旨在通過Genbiom對PRRSV殺滅效果的體外試驗來驗證Genbiom的殺毒能力，以期為PPRS感染的預防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PRRSV（分離株，1×104.25TCDI50）為高致病性藍耳變異株由金百麥生物科技有限公司提供，Marc-145細胞由哈爾濱元亨生物藥業有限公司提供，Genbiom干粉由金百麥生物科技有限公司提供，MEM培養基、DMEM培養基，胰酶購自GIBCO公司，新生牛血清購自山西潤生大業生物材料有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Marc-145細胞準備將Marc-145細胞以0.5-2×104/孔鋪到96孔板內，培養約12h，即長滿板底約70%時，將10% FBS DMEM培養基換成含2%FBS和1%雙抗的DMEM培養基，用于抗病毒效果評價。

1.2.2 Genbiom最大無毒用量摸索分別無菌稱取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高壓滅菌處理的Genbiom于1.5mL離心管中，然后分別加入500μL細胞培養液，震蕩混勻，加入1.2.1中準備的Marc-145細胞的細胞板，培養72h，觀察細胞病變情況（CPE），無細胞病變的最高量為該產品的最大無毒量。

1.2.3 Genbiom最低有效量測定分別無菌稱取25mg、50mg、100mg、200mg和400mg已高壓滅菌處理的Genbiom于1.5mL離心管中，然后分別加入100μL PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50），震蕩混勻，室溫下充分作用30min后，加入500μLDMEM培養基，反復震蕩混勻，靜置5min后，5000rpm，4℃離心5min，取30μL上清接種96孔長滿Marc-145單層細胞板，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養72h，觀察細胞產生CPE情況，同時分別設病毒陽性和無病毒的空白對照組，不產生CPE的藥物最小使用量為該產品的最低有效量。

1.2.4 Genbiom最短作用時間測定無菌稱取Genbiom干粉按1.2.2方法測定最低有效量200mg，與PRRSV病毒液（1×104.25TCDI50）進行作用，室溫下分別靜置5 min、10min、30min、60min，使Genbiom干粉與100μL病毒液充分作用。作用完后，加入500μLDMEM培養基，反復震蕩混勻，靜置5min后，5000rpm，4℃離心5min，取上清，分別將上清接種長滿Marc-145細胞單層的96孔細胞板，同時設陰、陽性對照。將接種后的96孔細胞板置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養72h，記錄細胞發生CPE的情況。

3 結果與分析

3.1 Genbiom最大無毒用量摸索

不同用量的Genbiom對Marc-145細胞的毒性作用分析如圖1所示。從圖1細胞生長狀況來看，本研究所選用的5種不同劑量的Genbiom，與陰性對照組相比，Marc-145細胞狀態均生長正常，無明顯的細胞死亡、圓縮及生長狀態不佳情況出現，表明至少用量至400mg的Genbiom對細胞無毒性作用。

3.2 Genbiom最低有效量測定

Genbiom最低有效量檢測結果如圖2所示。使用25mg Genbiom用量組與病毒作用后，加入Marc-145細胞，培養72h后在倒置顯微鏡下觀察，細胞大量死亡，出現PRRSV的典型病變；50mg用量組，細胞變圓縮、生長狀態不佳；100mg用量組，細胞出現少量的圓縮；當200mg和400mg Genbiom與病毒相互作用30min后細胞狀態均生長正常，無明顯的細胞死亡、圓縮及生長狀態不佳情況出現，未見到細胞病變；陰性對照組細胞生長正常，而陽性對照細胞大量死亡，陰陽性對照均成立。根據以上結果可以得出，Genbiom最低有效量為200mg。

圖1 不同用量的Genbiom對Marc-145細胞的毒性作用分析

圖2 Genbiom最低有效量測定

圖3 Genbiom最短作用時間測定結果

3.3 最短作用時間測定結果

Genbiom殺滅PRRSV最短作用時間結果如圖3所示。200mg Genbiom與病毒作用15min，加入Marc-145細胞，培養72h，在倒置顯微鏡下觀察，40%細胞出現了死亡、圓縮病變，而Genbiom作用30min、45min和60min，細胞與陰性對照相比，均無細胞病變。本試驗的陰陽性對照組均成立，最終確定Genbiom殺滅PRRSV最短作用時間為30min。

4 討論與結論

獸用消毒劑很多是復方消毒劑，研究人員已經對消毒類產品做過很多研究，對多種病毒、細菌及芽孢菌等殺滅效果也做了大量的對比試驗，但目前多數消毒劑為液體消毒，在豬舍內使用容易導致潮濕，尤其在非洲豬瘟影響下的養豬場來說，增加了病毒傳播的風險，急需一種可以干粉殺毒，無害無毒，綠色環保的新型消毒劑。

金百麥環境改良劑（Genbiom）采用國際先進的納米光催化技術，利用二氧化鈦（TiO2）半導體的效應，材料表面吸收氧和水分，產生降解環境污染物和抑菌殺菌的作用。例如，Genbiom具有良好的降氨能力［6］，能夠維持良好的養殖環境。TiO2在催化過程中具有較強的抑菌作用，可做與食品直接接觸的包裝材料和食品添加劑［7］。納米二氧化硅因為其良好的抗菌能力，已經作為醫療植入物在臨床中得到應用［8］。

此研究建立了以PRRSV為指示病毒的Genbiom體外殺毒的評價模型，重點評估了Genbiom最低有效量和最短作用時間，以期為PRRS的環境殺滅評估提供一種可行和敏感的方法。可適用于豬場環境及人員、水體消毒和家庭日常消毒等，是一種安全高效環保的環境改良劑。

本研究對Genbiom干粉對PRRSV殺滅效果進行了初步探究，雖然病毒在不同細胞株傳代易感性不同［9］，結果可能會有略微差別，但是本次試驗結果表明，Genbiom對PRRSV具有良好的殺滅效果，最低有效量為200mg，最短作用時間為30 min，同時根據Genbiom良好的殺毒滅菌能力，可用于豬場消毒及環境改良。