HPLC-ELSD法測(cè)定玉液消渴顆粒中黃芪甲苷的含量

趙俊蘋，秦 穎，郝美玲

(1.呼和浩特市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.巴彥淖爾市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015100；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

玉液消渴顆粒收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)成方制劑[1]，處方由黃芪、葛根、山藥、知母、天花粉、雞內(nèi)金、五味子、太子參八味藥組成，具有益氣滋陰的功效，用于糖尿病消渴乏力，口渴多飲，多尿癥。部頒標(biāo)準(zhǔn)中只收載了性狀和檢查項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)，標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，黃芪具有補(bǔ)氣、利水、固表止汗、生津養(yǎng)血、形滯通庳、托毒排膿等作用，是補(bǔ)氣的良藥，在玉液消渴顆粒中屬君藥，處方用量較大，所以首先考慮以黃芪的主要成分黃芪甲苷作為定量質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行研究，目前收集到兩個(gè)廠家共六批次樣品，其中一個(gè)廠家采用部頒標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，另一個(gè)廠家注冊(cè)時(shí)增訂了黃芪甲苷的含量測(cè)定，采用雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定[4]，此法費(fèi)時(shí)，操作繁瑣，方法檢測(cè)靈敏度低，測(cè)定的數(shù)據(jù)誤差較大，質(zhì)量可控性差，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部玉屏風(fēng)顆粒含量測(cè)定項(xiàng)下方法[5]，采用HPLC-ELSD法對(duì)玉液消渴顆粒中的黃芪甲苷含量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索，經(jīng)方法學(xué)考察驗(yàn)證后，陰性對(duì)照沒有干擾，方法準(zhǔn)確，可靠，用于有效控制玉液消渴顆粒的質(zhì)量是可行的。

1 材料

1.1 儀器

島津20A液相色譜儀(檢測(cè)器:Alltech-ELSD6000);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器；Sartorius電子天平。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-201515，供含量測(cè)定用，純度以93.0%計(jì));玉液消渴顆粒(陜西君碧莎制藥有限公司，批號(hào)20160401、20160802、20201202、20201203)，沈陽飛龍藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20151204、20151205)；甲醇、正丁醇、氨水為分析純，水為超純水，乙腈為色譜純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)，柱溫：30℃，流動(dòng)相：乙腈∶水(32∶68)，流速：1.0mL/min，檢測(cè)器漂移管溫度：108℃，載氣流量2.8L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約15g，精密稱定，置索氏提取器中，加入甲醇冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流至提取液無色(約6小時(shí))，提取液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，合并氨試液并用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20mL，棄去氨試液，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備

取本藥處方中除黃芪外的其他藥材，按玉液消渴顆粒的制備工藝制成顆粒，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系考察

取黃芪甲苷對(duì)照品2.732mg(純度93.0%)，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻(含黃芪甲苷0.2540mg/mL)，精密吸取5μL、10μL、15μL、20μL、30μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品溶液濃度的自然對(duì)數(shù)(X)對(duì)峰面積的自然對(duì)數(shù)(Y)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為： Y=1.626X+12.597 r = 0.9992，結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.270μg～7.622μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，陰性對(duì)照溶液無干擾，黃芪甲苷峰和相鄰雜峰良好分離，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算大于10000。色譜圖見圖1、圖2、圖3。

2.3.3精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1中對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得黃芪甲苷峰面積RSD為1.1%。表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，分別于0h、2h、4h、7h、9h、11h、14h進(jìn)樣20μL，測(cè)定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果黃芪甲苷峰面積積分值RSD為1.6%，表明供試品溶液在14小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批供試品(批號(hào)：20160401)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芪甲苷的含量，結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為0.096mg/g，RSD為1.1%，表明本方法重復(fù)性好。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的同一供試品(批號(hào)20160401，含黃芪甲苷0.096mg/g)9份，各約7.5g，精密稱定，置索氏提取器中，按低、中、高濃度黃芪甲苷對(duì)照品加入量與所取供試品中黃芪甲苷量之比約0.5∶1、1∶1、1.5∶1，分為3組，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液(黃芪甲苷對(duì)照品溶液濃度0.3925mg/mL,純度93.0%)1.0mL、2.0mL、3.0mL，加甲醇浸泡過夜，再加甲醇適量，加熱回流至提取液無色(約6小時(shí))，提取液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次……以下提取方法同“2.2.2供試品溶液制備法”……取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為93.5%，RSD為2.2%。

2.3.7樣品含量測(cè)定

取四批樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，每批樣品取兩份樣，計(jì)算含量，取其含量平均值，結(jié)果見表1：

表1 樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

2.3.8耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(“2.3.5”項(xiàng)下的1號(hào)和2號(hào)樣液)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)Agileng C18(250×4.6mm,5μm)柱和PhenomenexC18(250×4.6mm,5μm)柱進(jìn)行比較，結(jié)果，如表2：

表2 不同色譜柱的耐用性試驗(yàn)

3 討論

3.1 提取方法和時(shí)間的考察

在供試品提取方法中，用甲醇超聲處理和加熱回流提取樣品，結(jié)果超聲處理后的供試品溶液在放置過程中有絮狀沉淀，無法測(cè)定，故采用回流提取方法處理樣品。

供試品在加熱回流提取時(shí)，采用直接加熱回流2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)以及索氏回流提取(約6小時(shí))進(jìn)行考察，索氏提取測(cè)得含量略偏高，又考慮到索氏提取效率更高，故選擇索氏回流提取。

參照中國(guó)藥典一部[5]一些成方制劑，黃芪甲苷的提取方法都比較繁瑣，為了能簡(jiǎn)化提取方法，在實(shí)驗(yàn)摸索的過程中，參照中國(guó)藥典2020年版一部[6]黃芪藥材黃芪甲苷測(cè)定項(xiàng)下，供試品溶液的制備采用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液進(jìn)行加熱回流提取，結(jié)果供試品溶液粘稠，影響測(cè)定，考慮到玉液消渴顆粒為復(fù)方制劑，藥味多，制作時(shí)有大量輔料添加，故此法不宜。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[7]，黃芪甲苷屬于三萜皂苷，極性較大，難溶于丙酮、乙醚，在含水正丁醇中有較大的溶解性，針對(duì)黃芪甲苷的含量測(cè)定已有一些研究[8-9]，所以經(jīng)過試驗(yàn)，用水飽和的正丁醇進(jìn)一步提取黃芪甲苷是較好的選擇。

3.2 漂移管溫度和載氣流速的考察

基于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的特點(diǎn)，漂移管的溫度和載氣流速對(duì)基線的穩(wěn)定和峰面積影響較大，通過對(duì)漂移管分別為101.6℃、103℃、105℃、108℃四個(gè)溫度時(shí)，載氣流速分別為2.7L/min和2.8L/min之間進(jìn)行試驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8L/min時(shí)，峰面積值穩(wěn)定，基線平穩(wěn)，所以最終確定漂移管溫度為108℃，載氣流速為2.8L/min。