神農架地區酒曲馴養酵母的多樣性與特性研究

周繼慧，金學榮，涂 璇，望松柏，王洋洋

（三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443002）

酵母是一種生長于濕潤且偏酸性環境中的單細胞真核微生物，與人類生活生產關系密切，在烘焙、釀酒、油品脫蠟、藥物生產等方面應用廣泛[1]。神農架位于湖北省西部，屬于中緯度北亞熱帶季風區，古老漫長的地理變遷和相對封閉的自然環境，使神農架全境蘊藏著豐富的自然資源[2]。在該地區很早就有人類活動，釀酒歷史悠久，民間有許多釀酒作坊。由于所處地理位置的交通不便，這些釀酒作坊各自都使用自己傳統保留的酒曲來釀酒。酒曲常以米粉或麩皮等為原料,接入一定量的母曲或者采用自然接種,在一定溫度、濕度及通風條件下制成[3]。

酒曲中除了有豐富的糖化菌，同時酵母種類也十分豐富，對于酵母菌類群的分類，傳統的研究方法采用形態學鑒定和生理生化指標[4]。近年一系列的分子生物學技術也逐步應用到菌種的鑒定分類上來[5-7]，這使得分類步驟得以簡化，大大降低了工作的復雜性及縮短了實驗時間。人們對馴養動植物早已有了較為廣泛和深入的研究[8-9]，但對馴養微生物的研究還較為薄弱，甚至可以說是剛剛起步階段。美國研究人員通過對酵母基因序列分析，發現野生酵母與馴養酵母菌確實存在遺傳分化[10]。這一研究使得許多研究人員開始釀酒酵母菌群體遺傳學的相關研究。本實驗利用rDNA-ITS 序列對從酒曲中所分離的酵母菌進行鑒定并結合形態學特征和抗逆性能探討了酒曲中酵母菌的多樣性，對了解神農架地區酵母菌資源的多樣性，篩選優良性狀的釀酒酵母菌菌株，保護我國神農架地區的酵母菌資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒曲

酒曲原料：分別來自湖北神農架及周邊地區，神農架溫水林場、木魚鎮、興山，秭歸和宜昌。從9種不同酒曲中共分離獲得19 株酵母菌株，發酵特性參照安琪酵母。

1.1.2 培養基

分離純化培養基（YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，加入1000 mL蒸餾水，高壓滅菌后，臨用前加入氯霉素，使其終濃度為100 μg/L。

產子囊孢子培養基（McClary）：購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

發酵培養基：酵母抽提物0.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，氯化鈣1.8 g/L，葡萄糖10 g/L，pH4.0。

1.1.3 主要儀器和試劑顯微鏡OLYMPUS BX53，即用PCR 擴增試劑盒（上海生工），PCR儀（東勝龍），電泳儀DYY-2型（北京六一儀器廠），凝膠成像系統Gel.DocXR+(Bio-Rad),SDA-40D 生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所），pH 計(上海幫西儀器科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株的分離純化

稱取研磨的酒曲粉末1 g，加入99 mL 無菌水溶解均勻后再依次進行梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5稀釋菌液0.1 mL 進行涂布，28 ℃培養1～3 d；用接種環挑取可疑單菌落多次劃線分離得到純種，4 ℃保藏。

1.2.2 形態學觀察

將活化好的菌株接種于新鮮的YPD 平板，28 ℃培養1～3 d，觀察并記錄菌落形態；涂片后在顯微鏡下觀察細胞形態及是否出芽生殖；將活化后的酵母菌接種到McClary 平板上，28 ℃培養7 d 后顯微鏡觀察產子囊孢子情況以及子囊孢子形態。

1.2.3 抗逆性能測定

分別對酒精濃度、高溫、高糖、乙酸、糠醛類化合物的耐受性及抗凍融性幾個方面進行抗逆性能的測定。每個條件進行梯度設置，觀察菌種生長狀況[11-14]。

1.2.4 酵母菌rRNA-ITS區域分析

1.2.4.1 DNA的提取

DNA微量提取法[15]。

1.2.4.2 rRNA-ITS區域PCR反應

PCR擴增程序采用上海生工即用PCR試劑盒，引物為ITS1（tcc gta ggt gaa cct gcg c）和ITS4（tcc tcc gct tat tga tat gc）。

PCR 反應條件：94 ℃、5 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環后72 ℃延伸10 min[16]。

取5 μL PCR 產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上，于100 V，100 mA 條件下進行電泳檢測，電泳結束后用凝膠成像系統顯示結果。

1.2.4.3 測序及序列分析

PCR 原液送至武漢艾康健生物科技有限公司進行雙向測序，正反向引物分別為上述的ITS1 和ITS4。將測序返回的結果在線Blast 比對，對同源序列進行搜索，比較供試菌株與已知菌株序列的同源性，根據搜索結果的同源序列，用Clustal X 軟件進行匹配測試菌株的多重序列和相關的菌株，并采用mega6.0 軟件構建系統發育樹，對供試菌種進行多樣性分析[17-18]。

表1 酒曲來源及菌株編號分布

2 結果與分析

2.1 實驗材料的采集和分離

本實驗收集神農架地區不同地方共9 種酒曲，從中分離出22 株酵母菌株，根據來源與形態觀察，最后確定19 個菌株進行后續研究，酒曲采集的地點分布和分離的菌株編號見表1。

2.2 菌株的初步形態分類

2.2.1 菌落的形態觀察

將保藏的菌株在YPD 固體培養基上劃線培養，觀察不同菌株單菌落的形態、顏色等。從菌落圖片顯示，分離純化得到的菌株菌落主要為乳白色，淡黃色和深黃色，其中A-2.1、A-2.2、B-2.1 等為乳白色，A-3.1、A-3.2 等為淡黃色，G 為深黃色。其中B-2.1 菌落濕潤光滑，而A-1、D、F-1、F-2 菌落為放射狀或絨毛狀且表面干燥，不易挑起。不同菌株間菌落的形態比較多樣。菌落描述匯總見表2。部分菌落形態如圖1所示。

2.2.2 細胞形態觀察

對19 株菌進行觀察，結果顯示，大部分菌株細胞為橢圓形到球形，如A-3.1，B、1.1、B-1.2、G、M-3 具有典型的橢圓形；A-2.1，E-1 形態呈圓球形，與橢圓形有很明顯相異。19 株菌中統計得到球形菌株為4 株，橢圓形菌株有12 株，另有3 株介于圓形和橢圓形之間。細胞形態匯總見表2。部分細胞形態如圖2。

表2 各酵母菌菌株的形態學鑒定

2.2.3 子囊孢子的觀察

酵母菌接種到McClary 培養基中，培養7 d 后進行子囊孢子的觀察。結果顯示，A-3.1、B-1.1、B-1.2、G、M-3 具有較為明顯的子囊孢子產生。在其視野中可以觀察到有4 個孢子包裹在子囊中。M-2、A-1 視野中可以觀察到有3 個孢子被包裹在子囊中。但是在其他菌株中沒有觀察到子囊孢子的產生。子囊孢子產生與否見表2。部分菌株的子囊孢子形態見圖3。

2.3 抗逆性能實驗

2.3.1 耐酒精實驗

空白和加8%vol 乙醇的培養基平板上酵母均生長，但從圖片中可以明顯觀察到加乙醇的培養基中酵母生長明顯沒有對照組的長勢好。在10%vol乙醇的培養基平板上有18 株酵母生長，12%vol 乙醇的培養基平板上有19 株酵母生長，14%vol 乙醇的培養基平板上有4 株酵母生長，16%vol 乙醇的培養基平板上有12 株酵母生長。18%vol 的乙醇濃度中酵母均沒有生長。每個菌株的生長情況見表2。從表2 可以看出，編號為A-1、A-2.2、A-3.1、B-1.1、B-1.2、C-1.1、C-1.2、D、E-2.2、G、J、M-1、M-2 的酵母有較高的耐乙醇性能。菌種生長狀況統計如表3所示。

2.3.2 耐高溫實驗

從表3 可以看出，在40 ℃有15 株菌株生長，43 ℃有12 株菌株生長，而在45 ℃只有編號為J、F-1、B-2.1 3株菌株生長，菌種生長狀況如表4所示。

2.3.3 耐乙酸實驗

pH 值是影響酵母生長的重要因素，馴養酵母對pH值的適應范圍沒有野生酵母的廣泛。檢測19株酵母的耐乙酸程度，生長狀況如表4 所示，從表4可以看出，pH3.5 酵母均不生長，pH4 時只有編號為C-1.1、C-1.2的菌株生長如圖3所示，而在pH4.5時，所有測試的酵母都生長。可以得出結論，本實驗所用的釀酒酵母的最適生長pH值范圍是4.0～4.5。

表3 耐酒精實驗 (%vol)

表4 酒曲酵母菌耐受性 (%vol)

2.3.4 耐高糖實驗

將葡萄糖2%的為空白組和含高糖的培養基進行對照。在2%～40%的含糖濃度的培養基中酵母菌生長如表5，在含糖量達到48%時，有編號為A-1、A-2.1、A-2.2、A-3.1、B-1.1、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、E-1、E-2.2、G、M-1 的酵母有明顯的生長。可以得出本實驗所用酵母對糖具有很高的耐受能力。

2.3.5 酵母對糠醛類化合物的耐受能力實驗

從表6 可以看出，實驗所用到的酵母在培養基糠醛濃度為10～25 mmol/L 時，酵母均表現出生長的狀態，且在糠醛濃度為30 mmol/L 時有13 株酵母生長。可以初步得出馴養酵母對于糠醛具有較強的抗逆性。本實驗所用的A-2.1、A-3.1、B-1.2、B-2.1、B-2.2、C-1.1、C-1.2、D、E-2.2、F-1、G、M-1、M-2均對糠醛表現出抗逆性，生長情況見表6。

表5 酒曲酵母菌對葡萄糖濃度的耐受性

表6 對糠醛類化合物的耐受性

2.3.6 抗凍融試驗

將置于-20 ℃的冰箱里冰凍36 h 再解凍的酵母接種到YPD 培養基中培養24 h，發現酵母均生長，選出兩個長勢較好的平板如圖4。

2.4 PCR擴增

將提取的基因組DNA 作為模板進行ITS 序列的擴增，測序得到菌株ITS 序列片段大小為500～800 bp。PCR電泳圖譜如圖5所示。

2.5 ITS序列測定及分類研究

對實驗菌株進行基因組DNA 的提取后，擴增其ITS序列，將ITS序列測序返回的結果在NCBI上進行Blast 比對，然后用Clustal X 軟件進行比對，構建系統發育樹進行多樣性的分析。各菌株比對的結果如表2。N-J系統發育樹見圖6。

使用ITS1，ITS4 引物對19 株菌的ITS 序列進行擴增測序，得到19 個序列片段。ITS 序列測序結果表明（表4），所得到的序列長度為500～800 bp，Blast 比對結果顯示19 株實驗供試菌分成5 個屬，分別為Wickerhamomycessp.,Pichia sp.,Saccharomycopsissp.，Candidasp.，Saccharomycessp.。Blast 比對顯示，A-1、A-2.1、B-2.1、D、M-1、M-2 比對結果為100%，故可以確定這幾株菌的種屬。由比對的結果可以看出，從酒曲中分離出來的酵母大多數都屬于Wickerhamomycessp.，共分離出來8株（A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2），占分離菌種的42.1%；另外Pichiasp.有1株（A-1），占菌株總數的5.3%，Saccharomycopsissp.有3 株（E-1、F-2、J），占菌株總數的15.8%，Candidasp.有1 株（E-2.2），占菌株總數的5.3%，Saccharomycessp.（A-3.1、A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3）有6株，占總數的31.6%。由此可以看出，酒曲中的優勢菌群為Wickerhamomycessp.，其次為Saccharomycessp.。經過Blast 比對結果的相似度都在99%及以上，可以說明所分離出來的菌種都屬于已知菌株，明確了其分類的種屬。

將序列比對后構建系統發育樹，由實驗菌株的系統發育樹可以看出，19 株馴養酵母菌基本由5 個分支組成，A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2 這8 株菌構成一個獨立分支；E-1、F-2、J 3 株菌構成一個單獨分支；A-3.1、A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3 構成一個分支；菌株A-1 單獨處在一個分支上；菌株E-2.2 也單獨遠離分布在一個分支上。

菌株A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2 在系統樹上聚集在以Wickerhamomycessp.為代表的分支中。結合這一部分菌的形態學觀察發現，這一分支中的酵母菌其菌落形態基本都是濕潤的圓形突起，細胞形態均呈圓形，沒有觀察到子囊孢子的產生。但是在該分支中的菌株D 其菌落呈白色絨毛狀，和其他聚集在此分支上的菌株有較大的差別。E-2.2 聚集在Candidasp.這一分支上，該菌菌落呈現為淡黃色，較為濕潤，細胞形態為橢圓形。E-1、F-2、J聚集在Saccharomycopsissp.分支中，聚集在此分支上的菌株菌落形態均為白色絨毛狀，微突起形態，細胞形態從圓形到橢圓形不太一致。結合前面陳述的，Wickerhamomycessp.分支中菌株D 在形態上與此分支有著共同之處。A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3 聚集在Saccharomycessp.這一分支中，聚集在此分支上的酵母菌具有典型的釀酒酵母的菌落形態，其菌落均為淡黃色，濕潤的圓形菌落；且這幾株菌細胞形態為典型的橢圓形，結合比對結果及發酵性能可以確定這5 株菌即為釀酒酵母屬。

結合抗逆性實驗數據發現，以上19 株菌株中，除所屬Saccharomycopsissp.的3 株菌株中僅有J 具有較高的酒精耐受性外，其余種屬的大部分菌株均具有較高的酒精耐受性；但是在耐高溫的抗逆性實驗中，所屬Saccharomycopsissp.的3 株菌株中有兩株表現良好的耐受性，其余種屬的菌株的高溫耐受性較差；在耐高糖的抗逆性實驗中，發現所屬Wickerhamomycessp.的菌株表現良好的高糖耐受性，其余菌屬的高糖耐受性較差；除所屬Saccharomycopsissp 的菌株耐糖醛的性能較差外，其余菌株均表現良好的糖醛耐受性；在耐乙酸和耐凍融性實驗中發現，實驗所有菌株均表現良好的耐受性。因此實驗數據表明，菌株的抗逆性能與所屬種屬具有一定的關系，其中所屬Wickerhamomycessp.的菌株大多數表現有良好的抗逆耐受性。

3 結論

通過對神農架周邊地區酒曲分離出來的酵母菌進行形態學的鑒定，發酵性能的檢測及ITS 序列的測定，構建系統發育樹分析，確定各菌株之間的親緣關系，得到的結果如下：19 株馴養酵母經Blast比對，構建系統發育樹分析，分屬于5 個屬，分別為Pichiasp.（1 株），Wickerhamomycessp.（8 株），Saccharomycopsissp.（3 株），Candidasp.（1 株），Saccharomycessp.（6 株），其中優勢菌群為Wickerhamomycessp.和Saccharomycessp.；從（長陽）苞谷酒曲中共分離出5 株酵母菌，其中2 株屬于Wickerhamomycessp.，1 株Pichiasp.,2 株Saccharomycessp.；從神農架溫水林場小曲中分離出3 株菌，分別為1 株Wickerhamomycessp.，2 株Saccharomycessp.；從下牢溪老酒坊小曲中分離出2 株Wickerhamomycessp.；秭歸甜酒曲中分離出了1 株Saccharomycopsissp.，1株Candidasp.，1株Wickerhamomycessp.；張家界甜酒曲中分離出1 株Saccharomycopsissp.，1 株Candidasp.；從神農架木魚鎮酒曲得到1 株Saccharomycopsissp.以及1 株Saccharomycessp.；從興山甜酒曲中得到1 株Saccharomycopsissp.；從宜昌大曲中分離出2 株Wickerhamomycessp.，1 株Saccharomycessp.。結合菌種形態學研究、抗逆性實驗以及ITS 序列測定及分類研究，發現菌種的形態、抗逆性均與其所屬種屬具有一定的關系，其中絕大部分菌株可耐受pH4.0～4.5 以及-20 ℃的凍融環境，大部分可耐受16%vol 的酒精以及30 mmol/L 的糠醛濃度，只有B-2.1、F-2 以及J 可耐受45 ℃的高溫環境，一部分菌株可耐受48%的高糖濃度。此研究在一定程度上說明了神農架周邊地區馴養釀酒酵母多樣性較為豐富，且初步可判斷Wickerhamomycessp.的大多數菌株具有較好的抗逆耐受性，為這些菌株應用于工業生產提供了依據。但是由于樣品采集的局限性，該研究結果只能作為后續研究的一個指導，對于需要得到更加準確的研究結果必須擴大樣品的收集，結合相關的生理生化指標進行。