金種子優質窖泥高產己酸菌的篩選鑒定及其應用性能分析

程 偉，李 娜，張 杰，潘天全，彭 兵，鞏子路，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽金種子集團有限公司檢測中心，安徽阜陽 236018）

濃香型白酒在白酒市場上的銷售占有率較高， 是最普遍的一種白酒香型，主要分布在四川、蘇魯豫皖等地區，其產量和質量對白酒行業的發展具有重要的影響[1]。濃香型白酒主體香味物質己酸乙酯，是由己酸菌產生的己酸與發酵過程中產生的乙醇發生酯化反應而成，己酸菌作為窖泥中的重要功能微生物，對濃香型白酒風味的形成具有重要作用[2-3]。篩選出優質高產量的己酸菌是眾多學者研究的重要方向，高素潔等[4]從富裕酒廠窖泥中分離1 株高產己酸菌株，其己酸含量最高可達540 mg/100 mL；謝圣凱等[5]采用厭氧法從窖泥中篩選出Clostridium guangxiensestrain xsk1 和Clostridium kogasensisstrain xsk2 己酸菌，其己酸產量分別為4.51 g/L、2.5 g/L。窖泥質量的優劣影響著濃香型白酒質量，窖泥質量不僅取決于其理化指標，更取決于窖泥中有益窖泥功能菌的種類、數量及產物的代謝能力，以及營養成分的合理比例，窖泥養護及人工窖泥復配中離不開己酸菌液的應用[6-8]。本研究采用乙酸鈉培養基從優質老窖泥中篩選出高產己酸菌，從溫度耐受性、乙醇耐受性及己酸菌液的硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、乙醇等添加量對己酸產量的影響等方面研究篩選己酸菌的生理生化特性，并結合16S rDNA 分析及其系統發育學地位，從而為窖池養護及人工窖泥培養提供優質菌株及其培養條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品來源

優質老窖泥：取濃香型釀酒車間13 個大曲酒發酵老窖池的優質窖泥，作為菌種篩選的樣品來源，并分別編號為JKY1-JKY13。

1.1.2 培養基

乙酸鈉培養基(質量分數%)：乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸銨0.05%、碳酸鈣1%，乙醇2%（培養基滅菌后再添加），pH6.5，瓊脂粉1.5%～2%（液體培養基不添加）。

1.1.3 試劑與儀器

試劑及耗材：乙酸鈉、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、瓊脂粉、碳酸鈣等，生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸銅（分析純AR），安徽雨軒科技有限公司；己酸（色譜純）、內標2-乙基丁酸（色譜純），成都西亞試劑公司；乙醇、乙醚，國藥集團化學試劑有限公司；厭氧袋、耗氧劑，日本MGC公司。

儀器設備：LRH-250F 生化培養箱、DHG-9145A 電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；Velocity 18R 臺式冷凍離心機，澳大利亞Dynamica 公司；Spectramax 384plus 分光光度計，美國MD 公司；2010 型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器、全自動進樣器、自動進樣針），日本島津公司；DB-FFAP 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 己酸菌分離篩選及純化

將乙酸鈉液體培養基裝入試管中(裝液量90%)，向試管中加入1 g 老窖泥，80 ℃水浴熱處理10 min，封口膜密封，37 ℃發酵培養7 d，得到發酵液。用乙醚萃取發酵液，并用硫酸銅顯色法[9]初篩，藍色為陽性；取初篩為陽性的菌液1 mL，添加到裝有乙酸鈉液體培養基的試管中，80 ℃水浴熱處理10 min，密封，37 ℃培養7 d；重復純化2～3 次，得到純化后發酵液。將獲得的純化后發酵液進行梯度稀釋，并在乙酸鈉固體培養基中涂平板，37 ℃培養7 d后，挑取單個菌落進行液體發酵，并通過氣相色譜對發酵培養得到的菌液中己酸含量進行檢測。

1.2.2 菌體密度檢測

在乙酸鈉液體培養基中接入5%的己酸菌JZZ種子液，以37 ℃恒溫培養3～18 d，每天取培養液液面10 cm 左右菌液樣品，采用分光光度計對發酵液菌體密度OD600值進行檢測。

1.2.3 己酸的氣相檢測

將獲得的發酵液經0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到過濾液；取過濾液500 μL 于5 mL 容量瓶中，加乙醚定容至5 mL，充分振蕩2 min，靜置1 min，吸取上層乙醚萃取液，即為己酸，備測。實驗設置多次重復，重復實驗樣品分別編號為1、2、3、4、5、6。通過氣相色譜對乙醚萃取液中的己酸含量進行檢測。色譜條件為：進樣口溫度240 ℃；柱箱起始溫度：100 ℃(1 min)；升溫速率：10 ℃/min；柱溫終溫度：220 ℃(2 min)；檢測器溫度250 ℃；氣體流量：氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣30 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比20∶1；進樣體積：1 μL。內標液的配制：準確稱取內標物2-乙基丁酸原液0.185 g 于100 mL 容量瓶中，用體積分數為60%乙醇水溶液定容至100 mL，配制1.85 mg/mL 2-乙基丁酸內標液待用。

1.2.4 己酸菌JZZ的溫度、乙醇耐受性

將獲得的種子液按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養基的三角瓶(裝樣量90%)中，制備兩組，一組分別在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃的條件下厭氧培養7 d，另一組向三角瓶中添加乙醇，使乙醇在培養基中的體積分數分別為2%、4%、6%、8%和10%，37 ℃厭氧培養7 d 后，兩組分別得到發酵液。通過乙醚提取己酸并運用氣相色譜法檢測各個發酵液中的己酸產量，每個樣品3 個重復，觀察溫度及乙醇含量對產己酸量的影響變化。

1.2.5 培養液配方組分單因素含量影響

以己酸菌JZZ和窖泥混合菌的比例為1∶1配制己酸菌JZZ 和窖泥混合菌復配物，培養溫度37 ℃，每3 d 進行取樣檢測培養液的己酸含量并觀察菌體生長情況，取樣時每次取3 支2 mL 離心管作為平行，以1 mL 移液器槍頭長度為標準每次進行取樣。在不改變培養基其他組分的條件下，測定0.005%、0.01%、0.02%、0.04%硫酸鎂添加量對己酸含量的影響；在不改變培養基其他組分的條件下，測定0%、0.05%、0.1%、0.15%硫酸銨添加對己酸含量的影響；在不改變培養基其他組分的條件下，測定0%、0.05%、0.1%、0.15%磷酸氫二銨添加量對己酸含量的影響；在不改變培養基其他組分的條件下，測定0%、4%、8%、12%、16%乙醇終濃度添加量對己酸含量的影響。

1.2.6 己酸菌JZZ的形態觀察及其16S rDNA鑒定

形態鑒定：單菌落形態觀察，經革蘭氏染色后鏡檢[9]。分子鑒定：委托上海美吉生物醫藥科技有限公司對菌株進行測序，提取菌株基因組，PCR 擴增16S rDNA 片段，擴增程序：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，24個循環，72 ℃、10 min。提交美國國家生物技術信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI），通過基本本地隊列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較分析，用MEGA6 軟件構建系統發育樹[10]。

2 結果與分析

2.1 高產己酸菌的分離篩選

2.1.1 己酸菌的硫酸銅顯色法初篩

己酸菌屬于能生成芽孢的梭狀芽孢桿菌，其孢子具有耐熱性，其營養細胞是不耐熱的，可以采用熱處理法淘汰較弱的芽孢，同時殺滅營養細胞和其他雜菌，使己酸菌株純化；因此，將分離培養7 d 后的己酸菌液在85 ℃恒溫處理10 min，冷卻后再接入新的培養液中培養，以達到純化己酸菌的目的。分別取JKY1-JKY13第二次己酸菌富集菌液2 mL，加2 mL 2%硫酸銅、1 mL 乙醚，搖勻，靜置封層，觀察乙醚層顯色反應，己酸含量定性檢測結果見表1。檢測結果初步表明，JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13等的產己酸能力較強。

表1 JKY1-JKY13硫酸銅顯色定性檢測

2.1.2 己酸菌的單菌挑取及高產菌株篩選

挑 取JKY8、JKY9、JKY10、JKY11、JKY12、JKY13 稀釋涂平板培養皿上，將形態不同的單菌落進行四區劃線分離，37 ℃厭氧培養7 d，有菌落出現，通過反復純化，獲取了大量單菌落（圖1）。

對分離純化后的菌種要進行顯微鏡觀察及發酵產物的定量檢測，以鑒別己酸菌。通過多次分離、純化、檢測，再選取菌體健壯、活躍、芽孢桿菌占優勢、產己酸高的優質菌株。從稀釋涂平板培養后的平板中挑取單菌落至液態發酵培養基，37 ℃厭氧培養7 d 后測己酸產量。由表2 可看出，JKY11-E1 的平均己酸產量為3.94 mg/mL，是己酸高產菌株，并將該菌株命名為己酸菌JZZ。

表2 不同編號樣品己酸菌產己酸量的檢測結果

2.1.3 己酸菌JZZ的己酸產量復測（表3）

如表3 所示，對己酸菌JZZ 的產己酸能力進行了6 次檢測，己酸產量測定值分別為：4.33 mg/mL、4.25 mg/mL、4.28 mg/mL、4.55 mg/mL、4.42 mg/mL、4.34 mg/mL，平均值為4.36 mg/mL。這表明己酸菌JZZ菌株不僅產己酸能力較強，而且產量較穩定。

表3 高產己酸菌JZZ的產量穩定性檢測結果

2.2 己酸菌JZZ的培養條件分析

2.2.1 己酸菌JZZ與窖泥混合菌的復配培養

己酸檢測結果及相關文獻對比表明[4-5]，己酸菌JZZ 是高產己酸的菌株。將乙酸鈉液體培養基于0.1 MPa 高壓滅菌20 min，冷卻后加入碳酸鈣和乙醇，按照5%的接種量加入己酸菌種子液。對培養的己酸菌液每天觀察產氣變化，并采用分光光度計對發酵菌液進行檢測，通過菌體密度OD600值對己酸菌JZZ 的菌體生長情況分析。結果表明，己酸菌JZZ的生長有明顯的規律。

己酸菌培養液可廣泛應用于濃香型大曲酒的灌窖、窖池保養、人工窖泥培養、酯化液的制作等，以改善和提高濃香型大曲酒的質量。如圖2 所示，己酸菌JZZ 的菌體密度在第9 天時達到峰值，然后呈下降趨勢，表明該菌制備窖泥營養液時，較適宜的接種或培養時間在7～9 d。己酸菌是重要的釀酒功能微生物，但單一菌種發揮作用有限，混合菌能提供多種釀酒微生物，協同提高窖泥的釀酒效果。混合菌JKY8 是第二次己酸菌富集菌液，硫酸銅顯色定性檢測表明，JKY8 具有較高的己酸產量。采用混合菌JKY8 與己酸菌JZZ 復配培養，不同培養時間取樣進行GC 檢測。如圖2 所示，復配混合發酵10 d 后己酸產量增速減慢，當混合菌∶己酸菌為1∶1 時，己酸產量優于其他復配比例組合，且具有產酸協同性，表明在人工窖泥制備時應該采用復合菌接種，有利于保證窖泥質量。

2.2.2 己酸菌JZZ的溫度、乙醇耐受性

將己酸菌JZZ 按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養基的三角瓶（裝樣量90%）分別在36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃和40 ℃厭氧培養7 d 后，運用氣相色譜法進行己酸菌己酸產量的測定，每個樣品做3 個重復。如圖3 所示，37 ℃己酸產量為4.36 mg/mL±0.09 mg/mL，39 ℃、40 ℃時的己酸產量分別是37 ℃的94%、88%，仍然表現出高產特性。在白酒釀造過程中，伴隨著糧醅的發酵進程發酵體系內部溫度會發生顯著變化。投料時初始溫度一般為20 ℃左右，隨著淀粉降解放熱，溫度逐步上升至35～40 ℃，之后會維持在這個水平或略有下降；當然，在窖池的不同位置，局部溫度也會不同，有的甚至達到40 ℃以上；另外，由于窖池開放式生產，受季節、早晚、陰晴等天氣變化，發酵體系溫度也將產生變化。這對菌株的溫度適應性有較高要求，己酸菌JZZ 在40 ℃時表現出高產特性，能適應釀酒過程中的溫度變化。

將己酸菌JZZ 按照5%的接種量接種到裝有乙酸鈉液體培養基的三角瓶（裝樣量90%），添加乙醇，使乙醇終濃度分別在2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol，厭氧培養7 d 后，運用氣相色譜法進行己酸菌己酸產量的測定。如圖3 所示，在乙醇濃度2%～6%的范圍內表現出高產，可耐受6%vol乙醇濃度，當乙醇濃度為8%vol 時，產量急劇下降。在白酒釀造過程中，伴隨著糧醅發酵進程發酵體系內部的乙醇濃度會發生顯著變化。發酵初期，隨著發酵進行，乙醇濃度逐漸積累，發酵后期達到3%vol～4%vol，局部可能更高。發酵體系乙醇濃度變化，要求窖泥功能菌具有一定程度的乙醇耐受性。目前，尚未有乙醇耐受性的高產己酸菌報道。己酸菌的高己酸產量是濃香型白酒釀造的追求目標，有的己酸菌菌株雖然高產，但對溫度變化和乙醇濃度變化適應性不強，導致生產效果不穩定等。己酸菌JZZ 菌株具有適宜溫度和乙醇的耐受性，對己酸菌菌株工業生產中的穩定性以及適應傳統釀造工藝具有重大意義。

2.2.3 己酸菌液配方組分單因素考察

2.2.3.1 不同硫酸鎂、硫酸銨添加量的影響

由圖4 可知，在不同硫酸鎂濃度添加中，在起始時間內己酸含量幾乎相同，之后隨著培養時間的延長，己酸含量隨著不同硫酸鎂濃度的添加呈現先增加后減少的趨勢，其中0.01%硫酸鎂濃度的添加量均有著較高濃度的己酸含量，表明硫酸鎂較適添加量為0.01%。在不同的硫酸銨濃度的添加下，初始時間內不同硫酸銨添加量己酸含量基本相同，隨著培養時間延長0%硫酸銨添加始終有較高的己酸含量，而其余組分濃度下的己酸含量相對較低且十分接近，因此可以說明硫酸銨添加量多少對最終己酸含量并無太大影響，而其他組分內pH 值較低而影響己酸的生成。然而考慮最終己酸菌培養液加入到人工窖泥中進行培養，因此考慮最終的硫酸銨添加量為0.05%。

2.2.3.2 不同磷酸氫二鉀、乙醇添加量的影響

由圖5 可知，磷酸氫二鉀濃度越高，己酸含量越大，但在磷酸氫二鉀濃度達到0.3%和0.45%時己酸含量已經趨于平穩，因此0.3%磷酸氫二鉀添加量為較適添加量。隨著培養時間的延長，培養菌液內己酸含量逐漸增大，比較不同乙醇添加量條件下的己酸含量，可以發現，2%vol 乙醇終濃度添加量條件下的己酸含量較大，表明在此培養條件下2%vol的乙醇添加為較適添加量。

根據上述硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、乙醇等因素在己酸菌液配方中的較適添加比例，結合己酸菌培養基組分分析，確定己酸菌JZZ 菌液配方：酵母膏0.1%，醋酸鈉0.25%，底鍋水10%，硫酸鎂0.01%，硫酸銨0.05%，磷酸氫二鉀0.3%，乙醇2%vol。

2.3 己酸菌JZZ的形態觀察及其16S rDNA鑒定

2.3.1 己酸菌JZZ個體及菌落形態觀察

對己酸菌JZZ 進行革蘭氏染色觀察個體形態。如圖6所示，己酸菌JZZ為革蘭氏陽性芽孢菌，單細胞為梭形、直桿狀，芽孢端生或近端生。在固體培養基培養7 d 后，形成圓形菌落，表面平滑、乳白色，有光澤，邊緣整齊，不透明。

2.3.2 己酸菌JZZ的16S rDNA鑒定

提取菌株JZZ 的總DNA 作為模板，采用通用引物27f 和1492r 進行PCR 擴增，得到含有己酸菌JZZ 菌株16S rDNA 保守區的片段并對其進行測序。JZZ 菌株的16S rDNA 序列測定由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。將菌株JZZ 的16S rDNA 序列提交美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通過基本本地隊列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較，用MEGA6軟件構建系統發育樹。

引物序列如下：27f（上游引物）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r（下游引物）：5′-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

表4 JZZ菌株16S rDNA的序列比對結果

研究表明，在細菌分類學16S rDNA的同源性大于97%的為屬內同種[11-12]。將菌株JZZ 的16S rDNA 序列在NCBI 中進行同源性比較，同源性較高的為克氏梭狀桿菌(Clostridium kluyveri)，同源性大于99%。如表4 與圖7 所示，結合菌株JZZ的形態與分子生物學特征，可知己酸菌JZZ 鑒定為克氏梭狀桿菌(Clostridium kluyveri)[13]。

3 結論與討論

在濃香型白酒傳統釀造生產中，老窖出好酒，發酵池越老酒質越好，老窖的重要特征在于老熟窖泥。窖泥老熟過程相當緩漫，長達數年甚至更長時間，人工制備窖泥養護液或己酸菌液對窖泥的養護具有重要作用[14]。本研究從優質窖泥中分離篩選高產己酸菌，考察培養溫度、乙醇濃度、pH 值等發酵條件對己酸產量的影響，分析己酸菌液配方組分單因素含量的影響等。結果表明，分離篩選得到的高產己酸菌JZZ 為革蘭氏陽性桿菌，屬克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri），其液態發酵己酸平均產量為4.36 mg/mL，該菌株的溫度耐受區間為36～39 ℃，乙醇耐受濃度為2%vol～6%vol，表明該菌株能夠較好的適應發酵過程中的溫度變化，并具有一定程度的乙醇耐受性。己酸菌JZZ 較適宜的菌液配方組分添加量為硫酸鎂0.01%，硫酸銨0.05%，磷酸氫二鉀0.3%，食用酒精2%vol，16S rDNA 比對結果表明，JZZ 菌株為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）。高產己酸菌的篩選及其生產應用對濃香型白酒的釀造及發酵生香過程具有重要價值，本研究分離篩選的高產己酸菌JZZ 具有優良的生產性能，其優化培養的己酸菌液在人工窖泥培養及窖池養護過程中的實際應用效果，包括對原酒產量和質量的影響、窖泥老化和板結的進程、窖泥功能微生物及其菌群變化等，還有待于進一步的跟蹤考察。