雄性大鼠盆神經(jīng)損傷神經(jīng)源性膀胱動物模型的建立

葛慶宇，肖峻，沈洲

近年來，由于診療技術的不斷提高，更多的盆腔腫瘤如卵巢癌、直腸癌及前列腺癌等在疾病早期即可被發(fā)現(xiàn)和診斷，并接受根治性手術治療［1］。然而，盆腔根治術中為了使病人獲得更高的術后生存率，手術范圍相對較大，極易造成神經(jīng)的牽拉、壓迫、電刀灼熱傷以及局部炎癥反應的發(fā)生，其中就包括了支配膀胱功能的自主神經(jīng)的損傷［2-3］。自主神經(jīng)又分為腹下神經(jīng)和盆內(nèi)臟神經(jīng)，神經(jīng)交叉走形之后匯合成盆叢。Aizawa等［4］發(fā)現(xiàn)盆神經(jīng)損傷后可導致膀胱逼尿肌收縮無力，同時伴有膀胱敏感度下降，從而引起膀胱排空障礙及尿潴留的發(fā)生，嚴重影響了病人的生活質(zhì)量。因此，盆腔根治術后所致的神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是一個亟待解決的醫(yī)學難題，近些年來越來越被重視。我們自2017 年6 月至2018 年6 月建立了一種盆神經(jīng)損傷后的神經(jīng)源性膀胱動物模型，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠（8 周齡；n＝16），體質(zhì)量為250～300 g，在光照/黑暗周期為12 h、自由飲水和定期提供食物的條件下飼養(yǎng)。本研究中所有動物均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心所提供。采用隨機數(shù)字表法將16只大鼠隨機分為兩組：A為神經(jīng)損傷組（n＝8），損傷雙側(cè)盆神經(jīng)；B為假手術組（n＝8），顯露但不損傷盆神經(jīng)。

1.2 建模方法 10%水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定大鼠，取下腹部正中切口，在手術顯微鏡下于前列腺背外側(cè)顯露大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)節(jié)，游離顯露大鼠盆神經(jīng)，血管鉗鉗夾2 min造成神經(jīng)損傷大鼠模型。假手術組顯露雙側(cè)盆神經(jīng)但不損傷。檢查大鼠腹腔內(nèi)無活動性出血后逐層縫合關腹。每日定時進行人工擠尿，將大鼠抓起使之直立位后，兩手食指從上向下擠壓腹部到大鼠骨盆處，重復動作3次。

1.3 清醒狀態(tài)下大鼠膀胱功能檢測 術后4周，參照Gao W 的方法對兩組大鼠進行尿動力學檢測［5］。將大鼠以10%水合氯醛麻醉，取腹部正中切口，5F聚乙烯導管插入膀胱的頂部，并用荷包縫合適當固定。將導管從皮下穿過并用縫線固定在背部皮膚上，以防止導管被大鼠拉拽。微量注射泵、壓力傳感器與T形管相連，排空空氣后，將壓力傳感器連接至BL-420 生物機能實驗系統(tǒng)（生物信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)BL-420，成都泰盟科技有限公司，成都，中國），并進行調(diào)零。將大鼠置于限制籠內(nèi)，待麻醉完全清醒后，輕壓下腹部排空膀胱，調(diào)節(jié)灌注泵以0.2 mL/min速度向大鼠膀胱內(nèi)灌注室溫下的生理鹽水，在尿液漏出時停止灌注，尿道口首次流出液體時的灌注容積記為膀胱最大容量。觀察BL-420 系統(tǒng)中記錄出的膀胱壓力曲線，記錄最大膀胱排尿壓（MVP）。重復以上操作3次，取平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.4 組織學檢測 膀胱測壓后，取兩組大鼠膀胱稱重，之后取材部分膀胱壁組織以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備成厚約6μm的石蠟切片，分別進行Masson 染色和VAChT 免疫熒光染色。Masson染色切片于顯微鏡下觀察并拍照，藍染的為膠原成分，紅染的為平滑肌。VAChT免疫熒光染色步驟：使用修飾的檸檬酸鹽緩沖液（Target Rretrieval solution；Dako，carpinteria，CA，USA）進行抗原修復并且淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。切片經(jīng)3%山羊血清封閉，0.3%Triton X-100破膜后，加入VAChT抗體（1∶50；Mouse；Santa Cruz）4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后，加入二抗羊抗兔，室溫孵育1 h，PBS 漂洗。PBS漂洗后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

利用Image Pro Plus 圖像分析軟件計算出各組大鼠膀胱逼尿肌組織Masson 染色切片中膠原纖維的面積比值和VAChT 免疫熒光染色切片中VAChT陽性神經(jīng)纖維占比，組間進行比較。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 術后4 周，神經(jīng)損傷組8 只大鼠中其中1只因切口感染合并血尿而死亡，存活7只；假手術組8 只大鼠均存活。取得膀胱組織，神經(jīng)損傷組大鼠膀胱體積明顯大于假手術組，神經(jīng)損傷組大鼠膀胱質(zhì)量（123.6±16.8）mg較假手術組（87.2±11.2）mg明顯增加（t＝5.099，P＝0.000）。

2.2 膀胱功能檢測 膀胱功能檢測中測得損傷組大鼠膀胱最大容量（3.45±0.45）mL 較假手術組（1.46±0.11）mL明顯增加（t＝12.150，P＝0.000）。

圖1是兩組大鼠在清醒狀態(tài)下膀胱最大排尿壓（MVP）的結(jié)果。從圖中可以看出損傷組大鼠排尿壓上升幅度很小，其峰值為（12.1±6.5）mmHg，而假手術組大鼠膀胱內(nèi)壓在排尿前達峰值為（42.9±10.5）mmHg。因此，損傷組大鼠最大排尿壓較假手術組明顯降低（t＝7.054，P＝0.000）。

2.3 組織學結(jié)果 如圖2所示，膀胱組織的Masson染色顯示神經(jīng)損傷組（19.75±5.46）%的膠原沉積面積比例較假手術組（9.95±3.25）%明顯增多（t＝4.362，P＝0.001）。免疫熒光結(jié)果顯示損傷組（7.46±1.68）%VAChT 陽性神經(jīng)纖維占比較假手術組（12.67±3.24）%明顯減少（t＝4.038，P＝0.001）。

圖2 兩組膀胱壁組織Masson染色照片（×200）和VAChT陽性神經(jīng)纖維免疫熒光染色照片（×400）：A和C為神經(jīng)損傷組；B和D為假手術組（A和B Masson染色：藍染的為膠原，紅染的為平滑肌；C和D免疫熒光染色：紅染的為VAChT陽性神經(jīng)纖維，藍染的為胞核）

3 討論

神經(jīng)源性膀胱是由于神經(jīng)控制機制出現(xiàn)紊亂而導致的下尿路功能障礙，通常需在存有神經(jīng)病變的前提下才能診斷［6］。病因包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)因素、外周神經(jīng)系統(tǒng)因素、感染性疾病、醫(yī)源性因素，其中盆腔根治性手術是最常見的醫(yī)源性因素。研究顯示50%以上的直腸癌經(jīng)腹會陰直腸切除術病人術后會出現(xiàn)下尿路功能障礙，主要原因是手術過程中損傷了盆神經(jīng)支配逼尿肌的纖維［7］。Katepratoom 等［8］的一項調(diào)查顯示，約62.9%的病人在根治性子宮切除術后出現(xiàn)儲尿期癥狀，如尿頻、尿急、尿失禁等，42.9%的病人伴有排尿期癥狀，如排尿困難，尿潴留等。因此，建立盆腔根治術后的神經(jīng)源性膀胱動物模型對于研究此類疾病和如何提升病人生活質(zhì)量意義深遠。

Hannan等［9］曾通過夾閉雌性大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)叢發(fā)出支配膀胱神經(jīng)15 s×3 次建立神經(jīng)源性膀胱模型，結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后導致大鼠逼尿肌收縮力受損，逼尿肌纖維化。但由于夾閉時間較短，神經(jīng)損傷可能不徹底，從而導致神經(jīng)自我修復，以至恢復部分膀胱功能，影響實驗結(jié)果，因此本實驗通過延長夾閉時間至2 min，以消除客觀因素可能對實驗結(jié)果帶來的影響。并且，雌性大鼠盆神經(jīng)缺乏典型解剖標志，建立統(tǒng)一的模型較為困難，而雄性大鼠盆神經(jīng)解剖標志明確，位于膀胱內(nèi)上方、前列腺背外側(cè)，由盆神經(jīng)節(jié)發(fā)出，因此，本研究選用雄性SD大鼠研究，操作步驟較為簡單，大鼠模型統(tǒng)一可靠。此外，長期以來神經(jīng)源性膀胱動物模型的建立多選擇Hassan Shaker脊髓橫斷法［10］，本研究采用的模型制備方案的優(yōu)勢在于：①本研究術后大鼠不會出現(xiàn)雙后肢屬于拖行狀態(tài)不能參與行走的情況，避免了褥瘡的發(fā)生；②雙側(cè)盆神經(jīng)損傷更符合臨床盆腔根治術后神經(jīng)源性膀胱的發(fā)生情況，更具臨床意義；③本研究術后大鼠避免了繼發(fā)性脊髓感染等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，降低了術后護理難度及減少了大鼠死亡率。

盆腔根治術后神經(jīng)源性膀胱的根本原因在于逼尿肌纖維化，即大量膠原纖維沉積、平滑肌細胞凋亡，導致膀胱順應性下降，逼尿肌收縮無力，因而出現(xiàn)膀胱貯尿和排空障礙。本研究中，損傷組大鼠最大排尿壓較假手術組明顯降低，表明盆神經(jīng)損傷后大鼠逼尿肌收縮力明顯受損。Masson 染色示神經(jīng)損傷組逼尿肌中平滑肌減少而膠原含量增加，逼尿肌發(fā)生纖維化，免疫熒光示膽堿能（VAChT）陽性神經(jīng)纖維明顯減少，功能學和形態(tài)學均符合神經(jīng)源性膀胱的特征。

眾所周知，對于這種盆腔根治術后神經(jīng)源性膀胱，臨床上多數(shù)病人需行間歇導尿或接受恥骨上膀胱造瘺［11］，不僅容易造成反復感染，且生活質(zhì)量嚴重低下。而近年來，越來越多的研究表明利用干細胞移植治療可對脊髓損傷或糖尿病等原因所致神經(jīng)源性膀胱有較明顯的改善［12-13］。這是由于干細胞一方面在體內(nèi)或體外特定的誘導條件下，可定向分化為神經(jīng)細胞、平滑肌細胞、基質(zhì)細胞；另一方面干細胞可通過分泌多種促進神經(jīng)生長修復的神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進神經(jīng)的再生修復［14］。因此后續(xù)可以通過干細胞移植治療觀察是否能夠改善排尿功能，而具體選擇何種干細胞和移植途徑需要更深入的研究。

本研究證明通過損傷大鼠雙側(cè)盆神經(jīng)以建立神經(jīng)源性膀胱模型的方法是有效、簡便且可重復的，為盆腔根治術后神經(jīng)源性膀胱的研究提供了理論和實驗依據(jù)。