高半胱氨酸-羅丹明探針可視化檢測水溶液中Hg2+

李愛玲，趙秋媛，周麗波，楊 敏，張艷麗，張麗珠，王紅斌

(1.云南民族大學 化學與環境學院，云南 昆明 650500； 2.云南民族大學 民族醫藥學院，云南 昆明 650500)

Hg2+是一種極具生理毒性的化學物質, 溶解態的Hg2+往往具有較高的化學活性，是排入天然水體中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有較高的水溶性，也是各種汞形態轉化的樞紐.它對于人體蛋白中的硫醇組織和一些酶類都有非常高的親和性，從而導致不同的嚴重疾病，人類主要通過自然界的水接觸到汞污染[1],危害人類的中樞神經系統、腎臟、口腔以及皮膚等，甚至引起死亡[2-3].它具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性[4],且毒性很大極易揮發，給生態系統帶來較大的污染[5].所以，汞元素被列入全球環境監控系統中，其在生物體內及環境中的檢測方法受到人們的極大關注.因此，開發操作簡便、選擇性好、靈敏度高且成本低廉的汞離子檢測方法有非常重要的意義[6].

目前，檢測Hg2+的方法較多，但這些分析方法存在著操作方法復雜、測試時間長、需用到大型儀器等缺點[7].紫外-可見吸收光譜，統稱為電子光譜，是材料在吸收10～100 nm光波波長范圍的光子所引起分子中電子能級躍遷時產生的吸收光譜.紫外-可見吸收光譜法具有操作簡便、快速，靈敏度高[8-9]，運用與測量范圍廣泛，儀器簡單價格相對較低，易于普及推廣等特點[10].高半胱氨酸又稱同型半胱氨酸是人體內含硫氨基酸的一個重要的代謝中間產物[11]，是維持細胞和組織生長，以及生物氧化還原平衡的重要物質[12]，血液中 Hcy 的濃度水平被認為是動脈粥樣硬化等心血管疾病發病的一個獨立危險因子.羅丹明類探針技術近年來發展迅速，且羅丹明類化合物具有高摩爾消光系數、高熒光量子產率、良好的光穩定性以及較寬的波長范圍等光學性質，特別是對其進行結構修飾后得到的螺環結構羅丹明衍生物更具研究前景[13].

本文通過引入含有親汞基團的高半胱氨酸，合成了探針Hcy-Rh6G2，建立了一種對汞離子的可視化檢測，且當CH3OH/HEPES的體積比在 1∶1時，紫外吸收強度已經接近最大.利用紫外-吸收光譜研究其對Hg2+的識別過程，發現對Hg2+的識別效果很好.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗試劑

二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氧化鋁粉、探針分子Hcy-Rh6G2在文獻[14]中合成，所有試劑均為分析純.

1.1.2 實驗儀器

UV2100紫外-可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)；AV 400V核磁共振儀(BRUKER)；EF20 pH酸度計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SHZ-D循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 探針的性能測試

取Hcy(0.1 mmol/L)溶液 2 mL加入到裝有 2 mL 化合物RS1(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反應瓶中，中間體RS1按文獻[15]報道的方法合成.再往里面加入 2 mL化合物Rh6G2(0.1 mmol/L)，將他們混勻后在常溫下反應 2 h，用于測試.測試的激發狹縫寬度為 2.5 nm、發射狹縫寬度為 2.5 nm、激發波長為 510 nm、電壓為 400 V，探針的紫外-可見吸收光譜在HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH=7.00)的緩沖溶液中測試.

1) 不同緩沖溶液中對Hg2+的檢測.在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)緩沖相中，加入 25 μmol/L的Hg2+，量為熒光溶液的20倍，其他條件都一致，反應 24 h,測定溶液的紫外-可見吸收光譜.

2) 離子選擇性實驗.通過紫外-可見吸收光譜檢測探針對金屬離子的選擇性識別，將溶液的pH值調整為7，加入3.996 mL濃度為50 mmol/L的HEPES緩沖液，在7.996 mL CH3OH/H2O(V/V約1∶1)溶液中分別加入40 μL Cu2+、Al3+、Cd2+、Co2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、Ni2+，Fe2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和 400 μL的Hg2+金屬離子溶液，搖勻后，放置 24 h進行識別檢測.

3) 不同濃度的Hg2+對探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響.取Hcy(0.1 mmol/L)水溶液 2 mL加入到裝有 2 mL Rh6G2(0.1 mmol/L)甲醇溶液的反應瓶中，進一步將Hcy和Rh6G2稀釋成濃度為 50 μmol/L，常溫下反應 2 h后，加入 3.996 mL濃度為50 mmol/L的HEPES緩沖液，并逐漸增大Hg2+的濃度，搖勻后，放置 24 h，測定溶液的紫外-可見吸收光譜.

4) 陰、陽離子的干擾實驗.為了研究其他常見陰、陽離子對Hg2+的影響，進行了其他常見陰、陽離子的干擾實驗，分別加入其他常見離子和Hg2+到7.996 mL(VCH3OH:VH2O=1∶1)溶液中，放置 24 h，檢測體系的紫外-可見吸收光譜.

2 結果與討論

2.1 分子探針Hcy-Rh6G2性能研究

2.1.1 不同緩沖溶液對探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響

不同緩沖溶液對探針Hcy-Rh6G2的紫外-可見吸收光譜影響進行了測試，在水相、HEPES(pH=7.00)和Tris-HCl(pH=7.00)緩沖相中，加入Hg2+的量為熒光溶液的20倍25 μmol/L，反應 24 h，測定溶液的紫外-可見吸收光譜.結果表明，如圖1所示，Hg2+在HEPES緩沖相中產生粉紅色熒光，在水相中和Tris-HCl緩沖相中幾乎沒有顏色變化.不同緩沖相下探針Hcy-Rh6G2對汞離子檢測的紫外吸收譜如圖2所示，Hg2+在HEPES緩沖相中可以引起探針紫外吸收光譜的明顯變化，吸收光譜強度最大，在水相中有較弱的吸收光譜產生，而在Tris-HCl緩沖相中幾乎無變化，說明HEPES緩沖相下探針Hcy-Rh6G2能夠更好的識別Hg2+.

2.1.2 探針Hcy-Rh6G2的離子選擇性

Rh6G2的醛基與Hcy反應形成經典的希夫堿結構，因分子內巰基較長的烷基鏈所產生的空間位阻導致Hcy不能與醛基順利發生環化反應誘導Rh6G2分子開環.當探針Hcy-Rh6G2加入Hg2+后，放置 24 h，如圖3所示.其中VCH3OH∶VH2O=1∶1,激發波長為 510 nm.Hg2+可以引起探針紫外吸收光譜的明顯變化，吸收強度增加最大，加入其他常見金屬離子，除Co2+的吸收強度有略微變化外，其它的紫外吸收強度幾乎為零，表明探針分子Hcy-Rh6G2對Hg2+具有相對較高的離子選擇識別性能.

2.1.3 不同濃度的Hg2+對探針Hcy-Rh6G2的紫外-可見吸收光譜的影響

不同濃度的Hg2+對探針Hcy-Rh6G2紫外-可見吸收光譜的影響也進行了測試，未加入Hg2+時，探針的紫外吸收強度幾乎為0，表明此時探針為閉環狀態.如圖4所示，加入Hg2+后，在 528 nm處出現一個新的特征峰，且紫外吸收強度隨Hg2+濃度的增大而增強，表明探針和Hg2+已經完全反應，螺旋胺環已經全部被打開，溶液顏色也由無色漸變成紫紅色.如圖 5所示，紫外吸收強度的增幅與Hg2+濃度呈線性關系，線性回歸方程為A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3),其中c為Hg2+的摩爾濃度，A為吸光度.

2.1.4 其它陰陽離子的干擾

為考察其它金屬陽離子和陰離子對探針Hcy-Rh6G2識別Hg2+的影響，還進行了其它金屬陽離子和陰離子的干擾實驗.在濃度為25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入濃度為0.1 mol/L的其它陰離子(Br-, I-, CO23, H2PO2-4, HPO-4, PO3-4, NO-2, NO-3, S2O2-3, SO2-3, SO2-4, HSO-3, HSO-4)40 μL后，如圖6所示，波長為528 nm處,紫外吸收強度幾乎沒變化，之后再加入Hg2+，紫外吸收強度顯著增強，除I-,Br-, 外，加入其他陰離子后探針的紫外吸收強度的增幅與單獨加入Hg2+后探針的紫外吸收強度的增幅相同，表明其他陰離子的存在未干擾探針對Hg2+的檢測.I-,Br-的加入使得探針的紫外吸收強度下降，是因為I-與Hg2+形成了四面體型[HgI4]2+,從而使Hg2+無法正常與RS1結合所致，從而使紫外吸收強度下降.

在濃度為25 μmol/L的Hcy-Rh6G2溶液中加入濃度為 0.1 mol/L的其他金屬陽離子40 μL后，如圖7所示，波長528 nm處紫外吸收強度幾乎沒變化，之后再加入Hg2+，紫外吸收強度顯著增強，加入其他金屬陽離子后探針的紫外吸收強度的增幅與單獨加入Hg2+后探針的紫外吸收強度的增幅相同，表明其他金屬陽離子的存在未干擾探針對Hg2+的檢測.是由于Fe3+的順磁性導致吸收強度淬滅.

2.2 溶劑體系(CH3OH:HEPES)的比例對反應的影響

從紫外吸收強度上看，如圖8在純甲醇或者隨HEPES緩沖液的量增加時，體系的紫外吸收強度逐漸增強，當CH3OH/HEPES的體積比在 7∶1～4∶4之間時，體系的紫外吸收強度較強.其中，當CH3OH/HEPES的體積比在1∶1時，紫外吸收強度已經接近最大.

2.3 探針Hcy-Rh6G2對Hg2+識別機理研究

為了探究探針Hcy-Rh6G2和Hg2+反應機制的可能性，先將Hg2+加入到探針溶液中，打開探針內酰胺結構，形成較大的共軛體系分子，產生了熒光，再加入過量的絡合劑EDTA，熒光強度幾乎無明顯變化，表明此識別過程不可逆，且體系中有水參與反應，證明此識別過程可能與水解有關.如圖9所示，通過水解產物的質譜分析發現，Q-TOFMS：([M+H])+理論值：415.20，觀測值：415.2013(m/z)的信號.

3 結語

本文通過引入高半胱氨酸，合成了探針Hcy-Rh6G2，利用紫外-吸收光譜研究其對Hg2+的識別過程.通過紫外光譜法研究結果表明，探針分子Hcy-Rh6G2在HEPES緩沖溶液中能快速、高選擇性的識別Hg2+，當CH3OH/HEPES的體積比在1∶1時，紫外吸收強度已經接近最大，具有較強的抗金屬陽離子和陰離子的干擾能力，并能通過溶液顏色變化實現對汞離子的感官識別，在2.50×10-5～2.250 0×10-4mol/L濃度范圍內，紫外吸收強度的增幅與Hg2+濃度呈線性關系，線性回歸方程為A=0.005 1c-0.103 2(R=0.995 3)，可應用于實際樣品中Hg2+的檢測.