玉米ZmMYB59基因啟動子的克隆及功能分析

葉浩田 鄭美霞 孫彩霞 趙光武

(浙江農林大學 農業與食品科學學院/浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300)

MYB 轉錄因子參與植物的生長發育、激素信號轉導、代謝產物的合成及逆境脅迫應答反應[1-4]。前期研究發現，MYB家族基因在玉米種子頂土萌發過程中受深播和GA大量誘導，是表達基因數最多的轉錄因子家族，其中ZmMYB59基因表達下調倍數最高[5]。因此，預測該基因可能抑制玉米種子頂土萌發的能力。

啟動子是基因轉錄的調控中心[6]，不僅擁有CAAT-box、TATA-box等基本作用原件，還存在某些響應逆境脅迫的順式作用元件，所以基因表達調控研究的基礎是啟動子的功能分析[7]。研究ZmMYB59基因啟動子的順式作用元件既可從分子水平探討與種子頂土萌發性狀相關基因表達的機制，又可通過構建該啟動子和GUS的融合基因，在水稻中研究該啟動子在根、莖和葉中的表達[8]。目前與玉米種子頂土能力相關的關鍵基因的研究尚未見報道，本研究對玉米ZmMYB59基因啟動子序列進行有目的的缺失，應用PCR 技術分別克隆ZmMYB59基因啟動子的不同片段，分別連接GUS報告基因，通過農桿菌介導法轉化到水稻中，檢測水稻根、莖和葉中的GUS活性來初步確定啟動子的功能區域[9]，旨在闡明ZmMYB59基因啟動子的功能及其作用方式，以期為玉米遺傳改良提供新的策略和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZmMYB59基因啟動子克隆所使用的植物材料為玉米自交系‘B73’，種子由本實驗室擴繁后，-4 ℃保存備用，遺傳轉化使用水稻材料是‘日本晴’。

pMD18-T克隆載體、ExTaq、T4連接酶、dNTP混合物、DL10 000TM DNA marker均購自Takara公司，DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、100%的乙醇、氯仿和異丙醇等其他試劑購自上海生工生物工程股份有限公司，PCR引物合成和DNA序列測定由上海擎科生物科技有限公司完成[10]。

1.2 ZmMYB59基因啟動子的克隆及序列分析

通過CTAB法從玉米自交系‘B73’幼苗組織中提取基因組DNA[11]，利用primer 5.0軟件設計引物(MYB59-P-1-F: ATACATGGTTTGTGATT-CTGAAT；MYB59-P-1-R: GTTACTACCACAC-TAACGTTG；MYB59-P-2-F: CACAATGTGGA-CTGCAGCAC；MYB59-P-2-R: GTTACTACCA-CACTAACGTTG)。

以玉米基因組DNA為模板PCR擴增啟動子序列，20 μL PCR反應體系為：PCR預混液10 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、基因組DNA 1 μL、ddH2O 7 μL；PCR反應程序：95 ℃ 5 min；之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，共35個循環；最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經檢測并回收目的片段，目的片段和pMD18-T載體重組并轉化大腸桿菌DH5α，經檢測為陽性克隆的菌液送上海擎科生物科技有限公司測序。使用PlantCARE(http:∥www.plantcare.co.uk/)軟件對ZmMYB59基因起始密碼子前2 000 bp的序列進行分析, 把ZmMYB59基因的2個啟動子片段分別命名為MYB59-P-1，MYB59-P-2。

1.3 pCXGUS-MYB-1K和pCXGUS-MYB-2K植物表達載體的構建

將目的基因與pCXGUS-P載體連接，獲得重組質粒分別命名為pCXGUS-MYB-1K, pCXGUS-MYB-2K(圖1)。挑出重組質粒，轉化農桿菌EHA105感受態細胞。參照蘇軍等[12]的方法轉化水稻‘日本晴’(圖2)。

1.4 轉pCXGUS-MYB-1K和pCXGUS-MYB-2K基因水稻陽性植株的鑒定

獲得轉基因苗后進行PCR分子鑒定：以轉基因水稻葉片DNA為模板，利用啟動子pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K上游引物及GUS下游引物5’GTTGCCCGCTTCGAAACCAATG 3’進行PCR。反應程序是95 ℃ 5 min；之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s；72 ℃ (1 kb/90 s、2 kb/150 s)共30個循環；最后72 ℃ 10 min[13]。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物[14]。

圖1 啟動子片段pCXGUS-MYB-1K(a)和pCXGUS-MYB-2K(b)的載體構建圖

(a)為誘導第7天；(b)為愈傷繼代培養；(c)為農桿菌EHA105與目的基因共培養2 d；(d)為篩選第21天；(e)為分化第25天；(f)為28～30 ℃生根培養。

1.5 轉基因水稻GUS組織化學染色

分別取T1代轉基因陽性水稻的種子，T1代轉基因陽性水稻的萌發期水稻幼苗和苗期的根、莖和葉，參照Jefferson等[15]的方法進行GUS染色，照相并記錄。

2 結果與分析

2.1 ZmMYB59基因啟動子片段的克隆

圖3可知，3、4、5號樣品獲得1 000 bp的條帶，為啟動子MYB59-P-1片段，但1、2號樣品未擴增出啟動子片段MYB59-P-1(圖3(a))；6～10號均擴增出2 000 bp片段的條帶，為啟動子MYB59-P-2片段(圖3(b))。

分別選擇5號和10號擴增片段測序后，采用DNAMAN 6.0軟件(http:∥xiazai.zol.com.cn/detail/38/374365.shtml)進行比對分析，結果表明，5號和10號與MYB59-P-1和MYB59-P-2的序列完全一致。

2.2 啟動子MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學分析

表1可知，除與啟動子MYB59-P-1和MYB59-P-2基本活性相關的TATA Box和CAAT Box以外，還存在許多與激素響應相關的元件，如響應ABA信號的ABRE元件；響應水楊酸信號的TCA-element元件；響應赤霉素的作用元件GARE-motif和P-box元件；與茉莉酸甲酯信號途徑相關的TGACG-motif元件；參與抗病和脅迫調節的TC-rich repeats元件；與分生組織特異性激活相關的GCN4-motif元件；參與玉米醇溶蛋白代謝調控的O2-site元件；與分生組織表達相關的CAT-box元件；參與熱應激反應的HSE元件。此外，還發現1個受干旱誘導的 MYB 結合位點的MBS元件。

M，DL10 000分子量標準；1～5，MYB59-P-1片段；6～10，MYB59-P-2片段。

表1 啟動子MYB59-P-1和MYB59-P-2中存在的順式作用元件

2.3 轉pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K基因水稻的陽性鑒定結果

圖4可知，轉基因水稻幼苗和表達載體pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K質粒均能擴增到目標條帶MYB59-P-1和MYB59-P-2，而野生型水稻幼苗沒有擴增到目標條帶。結果表明，ZmMYB59基因起始密碼子上游1 000和2 000 bp已整合到轉基因水稻基因組中。

M1，DL2 000分子量標準； M2，DL10 000 分子量標準；1，陽性對照；2，陰性對照；3～24，轉基因水稻陽性植株。

2.4 pCXGUS-MYB-1K、pCXGUS-MYB-2K轉基因水稻萌發期和苗期GUS染色分析

圖5所示，pCXGUS-MYB-1K轉基因水稻的種子未著色，pCXGUS-MYB-2K轉化植株的種子胚乳邊緣著色,表明pCXGUS-MYB-1K未驅動GUS在種子中表達，而pCXGUS-MYB-2K驅動的GUS在種子胚乳邊緣表達；pCXGUS-MYB-1K的轉化植株種子萌發后僅有芽尖著色，表明其僅驅動GUS在芽尖部位表達，而pCXGUS-MYB-2K的轉化植株的根與芽尖均有著色，根中維管束細胞著色較少，芽尖著色較深，表明pCXGUS-MYB-2K驅動的GUS主要在芽尖表達，而在根部維管束組織中表達較弱。

圖6可知，pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能著色，其中根部僅維管束細胞著色，后者的根、莖、葉著色均比前者深。推測ZmMYB59基因的啟動子沒有組織特異性，同時也說明起始密碼子前1 000 bp序列是啟動子發揮正常調控功能所必須的，且2 000 bp中可能存在增強啟動子表達的順式作用元件。

3 討論與結論

啟動子作為轉錄水平重要的調節方式備受關注,通過對啟動子的研究可以預測基因啟動子中重要的元件，還能由此對基因的表達模式進行研究。根據啟動子中相關順式作用元件的分布，將啟動子劃分為包含不同長度的缺失片段，并將缺失片段與帶有GUS報告基因的植物表達載體融合，通過比較不同缺失片段啟動報告基因表達的強弱及其在組織中的定位來鑒定啟動子缺失片段的時空表達特性與啟動子中相關順式作用元件的作用[16]。

(a)和(e)分別為轉pCXGUS-MYB-2K的T1代種子，萌發期GUS組織化學染色結果；(b)～(d)為轉pCXGUS-MYB-1K的T1代種子，萌發期GUS組織化學染色結果。(a)，(b)，(e)的比例尺為1 mm；(c)和(d)的比例尺為2 mm。

(a)～(c)依次為‘日本晴’野生型植株的莖、葉和根；(d)～(f)分別為pCXGUS-MYB-1K轉化植株的莖、葉、根；(g)～(i)分別為pCXGUS-MYB-2K轉化植株的水稻莖、葉、根。

孫永偉等[17]利用啟動子缺失的方法發現響應外源激素ABA的應答元件在啟動子序列660～2 000 bp。大豆rbcS[18]基因啟動活性最高的是長度為712 bp的啟動子，長度為1 089 bp的rbcS基因啟動子含有光誘導元件并且還有組織特異表達特性。PGHNBS[19]啟動子的調控元件中，-1 071～-959 bp 區域存在韌皮部特異表達元件，增強子元件位于-1 559～-1 420 bp。

本研究發現pCXGUS-MYB-1K轉化的T1代種子未著色，pCXGUS-MYB-2K轉化的種子的胚乳邊緣有著色。通過對MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學分析發現可能含有與胚乳表達相關的順式調控元件GCN4-motif有關，而調控模式需要進一步探究。葉榮建[20]通過突變體研究發現順式作用元件(GCN4-like motif)以負向調控元件身份來對EnP3-292胚乳特異表達模式進行調控。

pCXGUS-MYB-1K轉化材料的種子萌發期只有芽尖著色，pCXGUS-MYB-2K轉化材料的芽尖和根均著色，芽尖著色較深，根少量著色，并且GUS在MYB59-P-2的調控下表達量較高。苗期pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能染色，推測ZmMYB59基因的啟動子沒有組織特異性，同時也說明起始密碼子前1 000 bp是啟動子發揮正常調控功能所必須的；而后者的根、莖、葉染色均比前者深，說明起始密碼子前1 000 bp啟動能力不強，推測前2 000 bp中可能存在增強啟動子表達的順式作用元件。

綜上所述，MYB59-P-1在種子中沒有啟動功能,在萌發期和苗期啟動功能不強,在萌發期僅芽尖處發揮功能，而在苗期根、莖和葉中均有調控功能；表明MYB59-P-1在調控種子萌發時存在時空差異表達。啟動子的高效表達需要多個順式作用元件的協同及相互作用。通過對MYB59-P-1和MYB59-P-2的生物信息學分析,發現MYB59-P-2中存在大量的脫落酸應答元件(ABRE)、與赤霉素響應有關的順式作用元件(GARE-motif)、與分生組織特異性激活相關的順式調控元件(CCGTCC-box)、與胚乳表達相關的順式調控元件(GCN4-motif)、參與熱應激反應的順式作用元件(HSE)、參與玉米醇溶蛋白代謝調控的順式調控元件(O2-site)，本研究推測ZmMYB59基因的啟動子是組成型啟動子。組成型啟動子的調控不受外界條件的影響，所啟動基因的表達具有持續性，可顯著地提高外源基因在植物組織中的表達量，特別是在葉片和莖中，但不具備時空特異性。明確ZmMYB59基因的啟動子類型，有利于后期更好地研究該基因的時空表達模式。