番茄與黃瓜遠緣嫁接愈合口形成過程的組織解剖分析

吳 燁 劉雯倩 胡 茜 高麗紅 張文娜

(中國農業大學 園藝學院/設施蔬菜生長發育調控北京市重點實驗室，北京 100193)

園藝作物廣泛利用嫁接以保持良種品質、快速繁育、調整長勢、提高抗性、增加產量和改善品質[1-3]。前人多從激素水平、解剖學層面和營養運輸等層面研究遠緣嫁接砧穗間互作的生理機理[4-5]，但其分子機理尚不明確。隨著分子生物學研究不斷深入，研究發現嫁接砧穗間及愈合口處存在激素、RNA、蛋白質和脂類等信號分子的韌皮部長距離、細胞間短距離運輸[6]及DNA水平轉移[7]。這些信號分子構成了砧穗交流互作的主要信息物質，運輸過程中它們可調控轉錄、參與基因表達及蛋白翻譯，導致DNA甲基化、基因沉默和基因激活[8-9]，進而調控后期植物體生長發育及對逆境脅迫的適應性[10]，因此，明確砧穗間運輸的具體信號分子，解析其運輸如何調控砧穗互作成為了研究中首要函待解決的問題。但由于目前生產中常使用近緣種嫁接，砧木和接穗分別產生的信號分子同源性極高，其運輸性鑒定存在著一定困難，如果能夠使用不同科、種、屬或親緣關系更遠的物種分別作為砧木和接穗進行遠緣嫁接，如大豆與南瓜[11]、綠豆與甘薯[12]、大豆與番茄[13]等，不僅可獲得近緣或種內雜交不能獲得的優良特性，如提高植物觀賞價值和產量、抗逆抗病蟲性強、生長快和改進果實品質等[14]，由于遠緣嫁接砧穗親緣關系較遠，性狀差異較大，能產生各自物種特異性的信號分子，還便于使用分子生物學等方法鑒定信號分子的砧穗間運輸性，為砧穗互作研究的奠定了堅實的基礎。

眾所周知，嫁接口的愈合是嫁接苗成活的關鍵，與近緣親和性嫁接相比，遠緣嫁接由于砧穗的解剖結構和生長特性以及遺傳特性不同, 引起嫁接接口無法愈合，維管束無法成功連通而嫁接失敗[15-16]。因此，為了建立成功的茄科及葫蘆科作物的遠緣嫁接體系，便于探究二者間砧穗互作及信息交流的分子機理，以推進未來遠緣嫁接技術體系的優化和應用，本研究首先針對遠緣嫁接愈合及維管束連通過程的解剖結構進行分析，以黃瓜‘新泰密刺’、黑籽南瓜和番茄‘中雜9號’為試驗材料，下胚軸斜靠接方法嫁接番茄/黃瓜，近緣嫁接的黃瓜/南瓜和黃瓜/黃瓜作為對照，觀測嫁接苗生長形態和嫁接口愈合過程變化，旨在明確遠緣嫁接番茄/黃瓜愈合口形成過程中的細胞分裂及分化、細胞融合及維管束組織連通和砧穗間物質交流等過程，初步解釋二者嫁接不親和的解剖學機理。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料包括黃瓜品種‘新泰密刺’(CucumissativusL.)，南瓜為黑籽南瓜(CucurbitaficifoliaBouché.)和番茄品種‘中雜9號’(LycopersiconesculentumMill.)，為北京市重點實驗室中國農業大學園藝學院設施蔬菜生長發育調控研究室保存種子。

1.2 試驗方法

1.2.1種子處理與播種

黃瓜、南瓜及番茄種子放入56 ℃溫水中玻璃棒攪拌15 min，換上25 ℃常溫浸泡4～6 h后放置28±2 ℃黑暗條件下催芽，種子露白1～2 mm后，播種至50孔基質穴盤(54 cm×28 cm，草炭∶蛭石∶珍珠巖體積比=2∶1∶1混合基質)中，覆蓋保鮮膜放入光照培養箱培養(相對濕度:85%)。為保證嫁接苗粗度一致，便于下胚軸嫁接成活，播種順序為番茄子葉展平期，開始播種黃瓜，再一周后播種南瓜。

1.2.2下胚軸嫁接

當番茄幼苗第三片真葉長出，株高5.0～6.0 cm，黃瓜幼苗第一片真葉展開至直徑2 cm，株高為4.0～5.0 cm，南瓜幼苗兩片子葉完全展開，株高為2.5～3.5 cm，此時三者莖粗一致，約為0.3～0.5 cm。嫁接組合為番茄/黃瓜、黃瓜/黃瓜、黃瓜/南瓜(接穗/砧木)。用刀片將接穗子葉下方斜向上切出上斜仰角約60°斜面，同時保留接穗苗下胚軸長2.0～3.0 cm，斜面長度1.0 cm左右，同時用刀片在砧木子葉下方斜切，保留砧木下胚軸長3.0～4.0 cm，下斜俯角約60°，切面長度與接穗一致，然后將接穗與砧木切面對齊貼緊并用嫁接夾固定。

1.2.3嫁接苗管理

嫁接苗放置育苗套裝中，透明塑料蓋子上用噴壺充分濕潤，育苗基質澆透水，保持育苗裝置內小環境的濕度；將育苗裝置用保鮮膜密封后放入28±2 ℃ 培養箱中暗培養2～3 d(相對濕度：95%～100%)，然后轉入弱光培養3～4 d(相對濕度:100%;16 h 28 ℃光培養/8 h 18 ℃暗培養;光強為100～150 μmol/(m2·s))，期間適當通風，之后進行正常光照培養。使用塑料罩保濕并放入28 ℃培養箱暗培養，3 d后揭開塑料罩取下固定夾，之后轉入正常光照度繼續培養(相對濕度:100%;16 h 28 ℃ 光培養/8 h 18 ℃暗培養;光強:300～600 μmol/(m2·s))。

1.2.4嫁接苗形態變化觀察與成活率統計

嫁接后每天觀察接穗生長狀況，并對嫁接未成活苗的剔除和統計，分別于嫁接后第2、5、8和15 天作為時間點進行拍照，于第8和15天統計嫁接成活率。試驗為2018年重復3次的統計結果。

1.2.5嫁接愈合處石蠟切片制作與觀察

每種嫁接組合分別于第2、5、8、15 天作為時間點進行取樣，每個組合每次取樣隨機選取嫁接成活苗8株，截取嫁接口上下1 cm長莖段，使用FAA溶液固定，50%、70%、85%、95%和100%乙醇系列脫水，二甲苯透明置換，石蠟包埋，切片，莖段切片厚度8 μm。甲苯胺藍染色，中性樹膠封片制成永久切片觀察，光學顯微鏡(Olympus, CX41)，體式顯微鏡(Leica, M205A)觀測嫁接口組織細胞融合及維管束連通情況。

1.2.6嫁接苗維管束連通檢測

嫁接15 d后，取嫁接成活苗(接穗頂端有新葉長出)，根系浸入0.1% 酸性品紅溶液，6 h后使用體式顯微鏡檢測嫁接口，觀測莖木質部及地上真葉葉脈、新葉葉脈品紅染色情況，方法參考Marsch-Martiínez 方法[17]；參照HPTS染色方法[18-19], 嫁接苗地上部分葉片浸入1 mmol/L HPTS(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid, 8-羥基芘1,3,6-三磺酸)溶液，12 h后制作徒手切片，CLSM(Leica, SP8)觀測嫁接口下方的熒光情況。

2 結果與分析

2.1 不同組合嫁接苗形態變化與成活率

黃瓜分別與番茄、南瓜、黃瓜嫁接，嫁接后第2天砧穗接合在一起，成活率均為80%以上；5 d后嫁接口愈合完成，番茄/黃瓜成活率下降至50%左右；15 d后黃瓜與番茄異嫁接苗由于遠緣嫁接的不親和性逐漸死亡，存活率為17%左右；而黃瓜與南瓜，黃瓜、南瓜和番茄自嫁接始終成活，對照黃瓜自嫁接與黃瓜/南瓜除了部分萎蔫失水外，成活率保持在85%以上。初步摸清了嫁接口愈合的時間點變化(圖1和圖2)。

2.2 3種組合的嫁接口細胞分化及愈合

黃瓜/黃瓜和黃瓜/南瓜2種組合呈現嫁接親和狀態，嫁接后第2天黃瓜/黃瓜自嫁接的愈傷細胞薄壁細胞正常連接分化(圖3(a)～(d))；嫁接后第5天愈傷組織繼續分裂增殖，建立新的形成層與維管束組織，接穗與砧木間的空隙已經被逐漸填滿，砧木接穗二者細胞相互交錯生長，愈傷組織薄壁細胞互相連接，成為一體(圖3(e)～(h))；嫁接后第8天砧穗接口處的薄壁細胞已經分化出新的形成層細胞，且由該形成層分化出新的韌皮部和方形的小口徑導管分子，導管篩管相互溝通，愈合過程基本結束(圖3(i)～(l))；嫁接15 d后嫁接口分化出新的維管束輸導組織，砧穗連接為一體(圖3(m)～(p))。

異嫁接組合黃瓜/南瓜與黃瓜自嫁接組合基本一致，但黃瓜南瓜組合愈合進展整體較慢。嫁接后第2天仍能清晰看到嫁接口邊界隔離層，但細胞由胼胝質及愈傷組織連接，此時基本沒有薄壁細胞脫分化(圖4(a)～(d))；嫁接后第5天，愈傷組織開始增多，但砧穗愈傷組織并未完全連接，仍可看到顏色較深的嫁接口隔離層邊界染色線(圖4(e)～(h))；嫁接后第8天，愈傷組織已經完全連接，維管束組織及薄壁細胞繼續融合分化，但從橫切面可以看到尚無新生的導管分子(圖4(i)～(l))；嫁接15 d后輸導組織連接，形成統一完整的嫁接體，邊界細胞基本消失(圖4(m)～(p))。

遠緣嫁接組合黃瓜/番茄嫁接后第2天愈傷組織薄壁細胞靠在一起但未完全融合，邊界細胞依舊明顯，黃瓜與番茄的維管束呈現各自的顯著特征，即黃瓜的一套維管束由外韌、內韌和木質部細胞構成，番茄的韌皮部和木質部呈射線分布(圖5(a)～(d))。嫁接后第5天，雖然砧木與接穗在嫁接口正常脫分化出愈傷組織，但相互間不能融合，形成隔離層(圖5(e)～(h))。嫁接后第8天接穗與砧木木質部與韌皮部薄壁細胞均各自產生有脫分化的大量細胞團，且從縱切面可以看到導管分子縱向排列開始扭曲(圖5(i)～(l))；第15天，盡管有部分薄壁細胞分化，但不能真正愈合，未發生維管束輸導組織分化連通，愈傷組織邊界細胞依舊明顯(圖5(m)～(p))，并且番茄接穗有不定根發生，說明接穗急需吸取空氣中的水分及營養物質來維持地上部生長(圖5(o))。

(a)、(d)、(g)和(j)為番茄/黃瓜嫁接苗生長情況，右側圖為嫁接口放大;(b)、(e)、(h)和(k)為黃瓜/黃瓜嫁接苗生長情況，右側圖為嫁接口放大;(c)、(f)、(i)和(l) 為黃瓜/南瓜嫁接苗生長情況，右側圖為嫁接口放大;黃色箭頭示嫁接口。

2.3 嫁接苗的維管束連通情況

為檢測嫁接15 d的番茄/黃瓜嫁接口木質部是否真正連接，用1%的酸性品紅浸染砧木根部，檢測品紅隨著根壓和蒸騰拉力向地上部分的運輸情況，黃瓜/南瓜嫁接苗作為對照。6 h后檢測到酸性品紅經維管束尤其是木質部由根部吸收，向上運輸，在嫁接口處聚集(圖6(a)～(c)；圖7(a)～(c))。且接穗的輸導組織中均可以檢測到品紅染色，發現其定位于木質部細胞(圖6(d)～(f)；圖7(d)～(e))。嫁接口處染色情況證明品紅溶液可通過二者木質部連接而運輸，且還可以通過愈傷組織連接處邊界的縫隙以及細胞融合的間隙擴散至木質部，擴散進入接穗的木質部，并隨著蒸騰拉力作用向地上部分運輸(圖6(g)～(j)；圖7(f)～(g))。

為檢測嫁接15 d的番茄/黃瓜嫁接口韌皮部是否真正連接，韌皮部共質體運輸的特異性標記HPTS浸染番茄接穗的葉片，在保證Confocal熒光參數不變的條件下，結果表明12 h后HPTS可以在番茄接穗的葉片經共質體運輸至下胚軸(圖8(a)～(c))，但并不能通過嫁接口運輸至黃瓜砧木(圖8(d)(木質部為自發熒光)。但在黃瓜/黃瓜的自嫁接對照中，12 h后可檢測到HPTS從黃瓜接穗運輸至黃瓜砧木(圖8(e)～(f))。

每種組合的平均嫁接株數分別為：番茄/黃瓜92～100，黃瓜/南瓜45～60，黃瓜/黃瓜35～40; 試驗為1個月內3次嫁接統計結果

(a)、(e)、(i)和(m)為黃瓜/黃瓜嫁接口橫切面圖;(b)、(f)、(j)和(n)為(a),(e),(i)和(m)中白框的放大;(c)、(g)、(k)和(o)為黃瓜/黃瓜嫁接口縱切面圖;(d)、(h)、(l)和(p)為(c)、(g)、(k)和(o)中白框的放大;黑色箭頭指示嫁接口愈傷邊界細胞;X,木質部；P,韌皮部；EP,外韌皮部；IP,內韌皮部；Pa,薄壁細胞。

(a)、(e)、(i)和(m)為番茄/黃瓜嫁接口橫切面圖；(b)、(f)、 (j)和(n)為(a)、(e)、(i)和(m)中白框的放大；(c)、(g)、 (k) 和(o)為番茄/黃瓜嫁接口縱切面圖；(d)、(h)、(l)和(p)為(c)、(g)、(k)和(o)中白框的放大；紅色箭頭指示黃瓜砧木，藍色箭頭指示番茄接穗，黑色箭頭指示嫁接口愈傷邊界細胞;X，木質部；P，韌皮部；EP,外韌皮部；IP,內韌皮部；Pa,薄壁細胞。

3 討 論

園藝作物生產中廣泛利用嫁接技術，砧木和接穗的親和性直接影響了植株的生長發育和開花結果、抗性及產品品質[20-21]，同時嫁接也是研究植物體內物質運輸、成花機制、信號轉導、細胞識別機制等基礎理論的重要方法和手段[22-24]。砧穗間的互作關系一直是一個熱點研究問題[25-26]，近年來研究發現嫁接作物的韌皮部含有一系列蛋白質和RNA 分子，可由源器官長距離傳遞至庫，調控根、頂端分生組織、葉片、地下塊莖發育，如CmNACP、SHR、GAI、KNOTTED1、StBEL5、PFP-Let6[27-30]；調控接穗的頂端分生組織細胞命運，如CmSTM、PbWoxT1[31-32]；提高植物抗逆性，如miRNA399、CmGAI、CmWRKYP、CmPP2、Cmlec17、CmPP16、SlSSI[33-35]；調控植株開花，如siRNA、FT、CO、TFL、LEAFY等[19,36]。這為砧穗互作的機理研究提供了理論依據，對解決生產中的砧穗不親和問題及有針對性地園藝作物育種具有重要意義[37-39]。

(a)、(e)、(i)和(m)為番茄/黃瓜嫁接口橫切面圖；(b)、(f)、 (j)和(n)為(a), (e), (i) and (m) 中白框的放大；(c)、(g)、 (k)和(o)為番茄/黃瓜嫁接口縱切面圖；(d)、(h)、(l)和(p)為(c), (g), (k) 和 (o) 中白框的放大；紅色箭頭指示黃瓜砧木，藍色箭頭指示番茄接穗，黑色箭頭指示嫁接口愈傷邊界細胞，橙色箭頭指示番茄接穗的不定根; X，木質部；P，韌皮部；EP,外韌皮部；IP,內韌皮部；Pa,薄壁細胞；C.形成層。

與近緣嫁接相比，遠緣嫁接由于砧穗親緣關系較遠，基因組序列差異性較大，更利于DNA、RNA及蛋白質等信號物質的砧穗間運輸性鑒定，對砧穗間信息互作的機理研究非常有利，以往研究發現遠緣嫁接起源的基因沉默信號長、短距離運輸均可引起DNA甲基化及表觀遺傳變化，如控制影響植株光合能力、葉片性狀、逆境脅迫響應等母性遺傳的數量性狀等砧穗間葉綠體基因組遺傳物質交換等[40-41]，遠緣嫁接更容易導致新的嫁接雜種出現[42]，這也為探索有關遠緣嫁接產生雜種機制提供了新思路。

遠緣嫁接的研究基礎首先是需要砧穗完全愈合[43]，接合口的融合過程涉及到接穗和砧木之間細胞分裂及分化、胞間連絲形成、形成層分化和連接、木質部及維管束組織重建等過程，廣泛應用于近緣同科屬植物嫁接[44-46]。本研究中發現黃瓜自嫁接和黃瓜/南瓜親和性嫁接的嫁接苗嫁接口愈合在解剖學層面上的愈合過程大致為：嫁接后1～3 d形成隔離層，4～6 d愈傷組織出現并增殖，7～9 d愈傷組織分化連接，并開始建成形成層與輸導組織，第15天則嫁接部位維管束完全建成，嫁接苗正常生長存活。遠緣的番茄與黃瓜嫁接組合在嫁接后呈現不親和狀態，其主要表現為砧木與接穗在切口正常產生愈傷組織并分裂增殖，但薄壁愈傷細胞不融合，這也就導致后期愈傷細胞無法分化，盡管木質部有部分連接，可以保證接穗吸取一定的水分和離子，保證其不萎蔫，但實際中韌皮部輸導組織不能形成，接穗的光合同化產物及營養物質不能完全運輸，不能維持正常的生命生長活動。在番茄黃瓜的嫁接口愈合過程觀察中，從切片上可以看到接口邊緣始終存在的深色染色層，初步推斷這一隔離層即為砧木與接穗各自愈傷細胞不能正常融合連接的重要原因。

(a)番茄/黃瓜的嫁接口，虛線指示(b)、(d)和(g)的橫切部位；(b)黃瓜砧木橫切面；(c)黃瓜砧木的縱切面；(d)番茄接穗橫切面；(e)和(f)為(d)圖黑框的放大；(g)和(i)嫁接口橫切面；(h)為(g)黑框的放大,(j)為(i圖黑框的放大。Ep，表皮細胞；X,木質部；Ca，愈傷組織。橙色箭頭指示酸性品紅染色的維管束。

(a)黃瓜/南瓜的嫁接口，虛線指示(b)、(d)和(g)的橫切部位；(b)南瓜砧木橫切面；(c)南瓜砧木橫切面放大；(d)黃瓜接穗橫切面；(e)為(d)圖黑框的放大；(f)嫁接口橫切面；(g)為(f)黑框的放大。X,木質部;Ca,愈傷組織。藍色箭頭指示酸性品紅染色的維管束。

(a)番茄/黃瓜中的番茄接穗橫切，虛線框指示(b)的位置；(c)番茄接穗橫切放大；(d)番茄/黃瓜中的黃瓜砧木橫切面；(e)黃瓜/黃瓜中黃瓜接穗橫切；(f)黃瓜/黃瓜中黃瓜砧木橫切。EP.外韌皮部；X,木質部；IP，內韌皮部。白色箭頭指示HPTS在韌皮部的共質體運輸途徑。

酸性品紅可通過根部吸收，在蒸騰拉力和根壓作用下經木質部向地上部運輸，常用于檢測木質部的連通情況[17]。結果中番茄/黃瓜嫁接體的嫁接口處只是愈傷組織的融合連接，并未完全分化建成木質部細胞，部分品紅溶液通過愈傷組織連接處邊界的縫隙擴散進入番茄的木質部，并隨著蒸騰拉力作用通過莖木質部向接穗運輸(圖6)；HPTS(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid, 8-羥基芘1,3,6-三磺酸)分子包含3個磺酸鹽基團，在pH<0.7生理條件下攜帶電性而無法進入細胞，由于細胞膜的不透水性，HPTS常用于共質體及質外體運輸的標記，檢測韌皮部的連通情況[18]，番茄/黃瓜嫁接體顯然韌皮部細胞未能夠分化連接(圖8)，初步探明了番茄/黃瓜遠緣嫁接體接口愈合的形態解剖學機理。

綜上所述，通過本研究的初步結果，建立適當的遠緣嫁接體系，研究其當代及后代植株的遺傳及變異規律，探索變異來源及方向性；并探索嫁接誘變的機制，找出影響嫁接誘變的影響因素及其作用方式；將來可提供更多關于遠緣嫁接誘變分子水平的證據，開拓遠緣嫁接誘變的應用領域，對園藝作物種質資源的創制及揭示砧穗間互作的分子機制均具有重要意義。