喜馬拉雅旱獺對高原低氧環境的生理適應性研究

何 建 陳 芳 李海龍 趙延梅 楊漢青 余長升 馬 英* 郭新建

(1.青海省地方病預防控制所，西寧，811602；2.青海省第五人民醫院，西寧，810007；3.青海大學附屬醫院，西寧，810001)

高原低氧適應是指世居高原的人或動物為能在高原低氧環境中生存，經長期自然選擇所產生的一種非可逆但能穩定遺傳的形態結構及生理生化等方面的改變，是機體適應高原低氧環境的一種保護機制[1]。高原哺乳動物圍繞氧氣的獲取、運輸和利用通路在血液生理和生化方面的特征性變化，是低氧研究的重要基礎性內容，其適應機制主要是圍繞缺氧而建立起的一系列復雜的代償，也是近幾年研究的熱點問題。

血液是機體重要的內環境，直接參與機體物質代謝、能量代謝和復雜的生化過程。動物血液生理、生化指標不僅能反映生理狀況和健康狀況，也是反映機體代謝狀況最靈敏的指標之一。它是動物長期進化的結果，是對棲息環境長期適應的反映，因而具有物種特性，在研究動物適應性方面具有重要的參考價值[2]。高原動物低氧適應的生理與遺傳機制一直是亟待解決的科學難題，而青藏高原哺乳動物具有良好的適應高原低氧環境的特性，國內關于青藏高原動物血液生理指標的研究報道很多，多見于家牦牛(Bosgrunniensgrunniens)[3]、藏野驢(Equuskiang)[4]、野馬(Equuscaballus)[5]、藏綿羊(Ovisariessubsp.)[6]、藏豬(Susscrofasubsp.)[7]，小型嚙齒類的研究有高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)等[8]。

喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)屬嚙齒目(Rodentia)、松鼠科(Sciuridae)、旱獺屬動物，廣泛棲息于高寒草甸草原，主要分布在我國青海、西藏、云南德欽等地及與中國接壤的尼泊爾等國的青藏高原邊緣山地。喜馬拉雅旱獺作為青藏高原鼠疫的主要貯存宿主[9]，長期生活在低氧濃度環境中，對低溫、低氧及強紫外線等高原環境具有良好適應，是研究高原低氧適應機理的理想實驗動物。為更好研究喜馬拉雅旱獺對高原低氧環境的生理適應性，本文測定了連續梯度海拔分布的喜馬拉雅旱獺血液生理相關指標，對相應海拔段的喜馬拉雅旱獺心肺標本做了病理組織切片并進行了鏡檢。旨在分析旱獺在高海拔低氧環境下的血液生理變化，發現高原動物低氧適應的血液生理和心肺機能適應特征，為高原低氧對動物組織造成的損傷提供參考資料，對進一步揭示青藏高原野生動物低氧適應分子遺傳機制奠定基礎。

1 樣點選擇

結合青海動物地理區劃，選擇本省境內西部荒漠亞區的烏蘭縣(3 200—3 400 m)、青海藏南亞區的囊謙縣(3 600—3 800 m)、興海縣(3 800—4 000 m)、澤庫縣(4 000—4 200 m)作為現場采樣點，采用圈套法捕獲喜馬拉雅旱獺。樣點分布見圖1。

圖1 全球喜馬拉雅旱獺的分布區域(藍線標記區域，https：//www.iucnredlist.org/)和本研究喜馬拉雅旱獺采樣點分布圖(采樣點用紅色圓點標記)Fig.1 Global distribution area of Marmota himalayana(distribution area was marked with blue line，https：//www.iucnredlist.org/) and sample sites for Marmota himalayana in this study(sample sites were marked with red dot)

2 材料與方法

2.1 血液采樣

靜脈注射5%戊巴比妥鈉麻醉喜馬拉雅旱獺后，心臟采血3—5 mL，置于抗凝管并存放于冰盒。共采集旱獺血樣192份，其中烏蘭46份、囊謙46份、興海47份、澤庫53份。

2.2 血液生理指標測定

輕輕混勻血樣，采用PE6800 Vet全自動血液分析儀測定紅細胞數(RBC)、血紅蛋白濃度(HBC)、血細胞比容(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)等生理指標。生理指標用SPSS 18.0統計軟件進行多個樣本均數的兩兩比較分析，定量檢測結果用均數±標準誤表示。

2.3 喜馬拉雅旱獺組織病理學觀察

將現場麻醉后的喜馬拉雅旱獺解剖，取心、肺組織鹽水沖洗后固定于4%甲醛溶液，常規組織脫水、浸蠟、石蠟包埋組織、組織切片(厚4 μm)，HE染色，光鏡觀察。

3 研究結果

3.1 喜馬拉雅旱獺血液生理指標

本次實驗的各項血液生理指標統計值見表1，烏蘭縣喜馬拉雅旱獺血樣測定的紅細胞數(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血細胞比容(HCT)值最高，而囊謙縣旱獺的RBC、HGB、HCT數值最低。平均紅細胞體積(MCV)隨海拔的升高而降低，MCV減小，使RBC總表面積增大，氧和二氧化碳等脂溶性氣體通過RBC進行交換數量增多，這是旱獺為適應低氧而發生的血液生理改變。

表1 不同海拔喜馬拉雅旱獺各項血液生理指標平均值

Tab.1 Average blood physiological indexes of different altitude himalayan marmot

表2 不同海拔喜馬拉雅旱獺各項血液生理指標的單因素方差分析

Tab.2 One-way ANOVA analysis of variance of blood physiological indexes in marmot of different altitude

注：基于實測平均值，*平均值差值的顯著性水平為0.05

Note：Based on the measured average value，* The significance level of the mean difference was 0.05

表2通過生理指標組間數據單因素方差分析，紅細胞數、血紅蛋白在烏蘭、興海、澤庫3縣的喜馬拉雅旱獺之間無顯著差異，囊謙縣的這3項數值有顯著差異；血細胞比容在興海縣和澤庫縣之間沒有差異外，其他相互各縣之間均有差異；平均紅細胞體積在囊謙縣和興海縣之間沒有差異外，其他相互各縣之間均有差異；血小板數值在各縣之間均無顯著差異。

賈榮莉[10]測定喜馬拉雅旱獺的紅細胞數量為(5.82±0.78)×1012/L，血紅蛋白(145±17.0)g/L。陶元清[11]測得白化喜馬拉雅旱獺血液生理指標，其紅細胞數(5.98±0.74)，血紅蛋白含量為(154.21±13.75)，血小板數(365.58±173.29)，本實驗測得的紅細胞數、血紅蛋白含量及血小板數與文獻大致接近。

3.2 心肺組織學觀察結果

顯微鏡下觀察喜馬拉雅旱獺心肺組織的HE染色切片，4個地區的心肺切片中均有不同程度的損傷，詳見圖2、圖3。

圖2 不同海拔喜馬拉雅旱獺心肺組織切片(HE染色)Fig.2 Cardiopulmonary tissue sections of Himalayan marmot at different altitude(HE staining)

圖3 心肺組織切片局部放大圖(HE染色)Fig.3 A partial enlarged view of the cardiopulmonary tissue section(HE staining)

烏蘭縣：部分區域心肌細胞腫脹變性，肌橫紋模糊。肺間質有散在的炎癥細胞浸潤，終末細支氣管散在的淋巴細胞浸潤，血管充血，肺泡結構清晰。

囊謙縣：心肌細胞變性，肌橫紋模糊，細胞腫脹。肺間質內出血，部分區域有肺泡間隔增寬，肺泡腔內可見組織細胞，終末細支氣管可見淋巴細胞浸潤。

興海縣：心肌細胞肌橫紋模糊，肌細胞萎縮，心肌間有散在的出血，心肌細胞濁腫變性。肺間質充血、出血，炎細胞浸潤，肺間質增寬，肺泡上皮增生，部分脫落，肺泡腔內有液性滲出，組織細胞反應。終未細支氣管襯覆的纖毛柱狀上皮細胞脫落、變性壞死。

澤庫縣：心肌細胞間動脈血管充血，血管內皮損傷，靜脈淤血，心肌細胞變性，心肌橫紋模糊，細胞腫脹。肺泡間質內炎細胞浸潤，肺泡間隔增寬，纖維組織增生，間質內出血，肺泡上皮細胞增生、脫落，較多肺泡腔內有組織細胞反應，液性滲出，終末細支氣管襯覆的纖毛柱狀上皮細胞變性，部分區域脫落。

從喜馬拉雅旱獺心肺組織染色鏡檢結果發現，其心肌和肺泡細胞的形態結構、生理功能相應發生了一些變化，說明長期生長在海拔3 000 m以上的旱獺，已經適應了氧分壓低、紫外線強、寒冷晝夜溫差變化大等特點的高寒低氧棲息環境。

4 討論

血液生理特征是機體適應低氧環境的一個重要表現，血液生理指標能直接反應機體對低氧環境的適應性[12]。馮永志等報道[13]海拔3 700 m處空氣氧含量僅為海平面的59.3%，為適應這種嚴重缺氧，依靠一般的血紅蛋白攜氧能力和心輸出量的改變，已不能適應生理需要。馮信焰等[14]研究發現海拔越高，空氣中含氧量越低，HGB水平就越高，海拔高度與HGB水平呈正相關，高原低氧環境是影響HGB水平變化的主要因素。紅細胞數目(RBC)及血紅蛋白(HGB)的作用是增強高原動物機體運載氧能力，其含量增多是許多高原動物的血液學特征，且數值隨海拔升高而相應升高，原因可能是在缺氧環境下紅細胞代償性增加，通過增殖以及合成血紅蛋白來提高攜氧能力，以適應高海拔缺氧環境[15-16]。本研究中囊謙、興海和澤庫3縣的采集樣點生境均為草甸草原，并且喜馬拉雅旱獺RBC、HGB、HCT數值也隨著海拔的升高而呈上升趨勢，說明同一生境中，隨海拔的升高RBC、HGB、HCT值也會相應逐漸增加。烏蘭縣的生境類型為荒漠化草原，雖然海拔最低，但RBC、HGB、HCT值卻很高，提示我們棲息生境可能也是旱獺血液生理指標值的一個影響因素。

高原動物在長期適應低氧環境的過程中，紅細胞和血紅蛋白的變化有相同點，但由于不同高原動物的生活環境和生活習性不同，其紅細胞和血紅蛋白存在不同的適應特征。王曉君等[8]研究發現鼠兔以低血細胞比容(HCT)和低平均紅細胞體積(MCV)為特征，血氧利用率高。同時高原鼢鼠也表現出與鼠兔類似的血液性狀。藏羚(Pantholopshodgsoni)也有著與高原鼠兔相似的血液學特征，表現為低HBC和低HCT[17]。而野牦牛(Bosgrunniensmutus)、家牦牛、藏綿羊和藏山羊(Caprahircussubsp. )的血液具有較高的紅細胞數(RBC)和血紅蛋白濃度(HBC)。通過研究可以看出[18]，RBC的總表面積增大，氧氣和二氧化碳等通過RBC進行交換的數量增多，直接提高了單位體積血液的攜氧能力。但HCT升高會增加血液黏稠度和血液循環阻力，增加了循環系統負擔，以至于影響氧氣供應，甚至損害機體[19]。為了避免這種損傷，機體MCV隨海拔的升高而降低，適當降低了血漿的黏滯度，促進血流速度加快，從而提高機體氧代謝效率[20]。我們研究發現旱獺與藏綿羊、藏豬及牦牛等高原動物類似，適應高原低氧環境的生理特征主要表現為RBC和HGB增加，相對擴大的表面積使得更多的氧氣易于與紅細胞接觸，提高了氧氣運輸效率，而MCV的減小意味著平均紅細胞血紅蛋白含量變化幅度變小，將紅細胞內黏度維持在一個可接受的水平，從而一定程度上降低了高流速下的血液黏度，防止HCT的過度升高。同時MCV減小會增大紅細胞的總表面積，提高了內環境的氧氣交換效率，保證機體在低氧環境中機體氧氣供應的需要，從而提高機體氧代謝機能，這種血液特征進一步揭示了喜馬拉雅旱獺適應高原低氧環境的生理機制。

氧的利用和調節是高等生命生存的基本條件，低氧是許多重大疾病發生發展中的基本病理生理改變，而高原低氧存在于中國約220萬km2的高原地區，涉及高原低氧習服和低氧適應的重要進化機制[21]。國外資料表明，高原低氧對心臟重構的作用主要是指右心室重構包括心肌實質的改變、心室壁增厚或心腔擴大、質量和體積增加[22]。本研究喜馬拉雅旱獺的心肺組織HE切片顯示，4個地區的心肺組織均有不同程度的病變，高原缺氧導致在本區域內生活的喜馬拉雅旱獺心肺一定的損傷。說明喜馬拉雅旱獺長期生活在高原低氧環境中，經受地下洞穴中低水平的氧氣和高水平二氧化碳的環境，雖經過漫長的進化后存在一定的低氧適應，但這種適應并不足以替代缺氧對機體引起的損傷。