EGFR、ALK、p53蛋白的表達在肺腺癌預后評估中的價值

唐微，譚凌峰，以敏

廣西醫科大學第四附屬醫院柳州市工人醫院病理科，廣西 柳州 545005

肺癌在當今世界最常見的惡性腫瘤中高居首位，近幾十年來，隨著全球生態環境的惡化，肺癌的發病率逐年遞增，特別是肺腺癌，發病率的上升趨勢更明顯[1-2]，嚴重威脅著全球人類的健康與生命。肺腺癌早期沒有明顯的臨床癥狀，發生發展難以預測，早期肺腺癌多數在體檢時發現，出現癥狀的肺癌患者大部分已經是晚期，預后較差，死亡率高[3-4]。國內外學者研究了多種與肺癌相關的細胞因子，但有些結果卻不太一致，出現這種結果的原因主要是因為樣本數量、研究方法的不同以及腫瘤自身所具有的異質性造成的。表皮樣生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是HER/erB 蛋白家族成員之一，編碼跨膜酪氨酸激酶，參與細胞的生長與分化等過程[5]。有研究顯示胃癌及乳腺癌中EGFR過度表達預示其生存期短、預后較差，且EGFR突變與非小細胞肺癌發生發展密切相關，是其主要的致癌基因驅動因子[6]。因此，檢測肺腺癌組織中EGFR的表達并分析其與肺腺癌臨床病理特征之間的關系有助于了解其在肺癌發生發展中的可能作用機制。間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是受體酪氨酸激酶胰島素受體超家族的成員之一，位于染色體2P23，其發病機制通常源于染色體的重排。研究發現，部分肺癌患者發生染色體2P倒位，使ALK基因和棘皮動物微管相關蛋白樣基因EML4發生融合，從而導致肺癌的發生發展[7-8]。因此研究并鑒定肺腺癌進程中的關鍵蛋白ALK的表達對肺癌的預后發展及評估十分重要。p53蛋白原是腫瘤抑制基因p53的表達產物，p53基因的突變或缺失被認為是導致多種腫瘤發生的原因[9]。很多研究發現p53突變與卵巢漿液性腫瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤及呼吸道腫瘤等多種腫瘤的發生、進展、轉移以及治療的耐藥性相關，被認為是預后不良的因素[10]。因此研究肺腺癌發展進程中p53蛋白的變化十分直觀且重要。本實驗通過研究肺腺癌和肺炎組織中EGFR、ALK 和p53 的表達差異，EGFR、ALK 和p53 與肺腺癌臨床病理特征的關系及其三者之間的相關性，探討他們在肺腺癌的發生發展及預后評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取柳州市工人醫院病理科2015 年5 月至2017 年8 月的肺腺癌標本106 例(肺腺癌組)，肺炎性病變標本63 例(肺炎組)，所有標本均經病理確診，均為病理科包埋好的組織石蠟塊。肺腺癌組標本中，男性58 例，女性48 例；年齡30～76 歲，其中≥60 歲51 例，＜60 歲55 例；高分化腺癌33 例，中低分化腺癌73 例；無淋巴結轉移60 例，有淋巴結轉移46例；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期者43例，Ⅲ+Ⅳ期者63例。

1.2 試劑及方法 采用SP法進行免疫組織化學染色，操作過程包括切片、烤片脫蠟、脫水、滅活內源性過氧化物酶、抗原修復、抗體孵化、DAB 顯色、復染、封片等，以PBS 液代替一抗作陰性對照。EGFR 抗體、p53抗體及SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。ALK抗體檢測試劑盒購自羅氏公司，采用增強DAB檢測試劑盒和增強擴增試劑盒染色。

1.3 結果判讀 在光學顯微鏡下對EGFR、ALK和p53蛋白的表達情況進行判讀，EGFR蛋白表達判讀標準如下：根據腫瘤細胞染色的強弱程度評分，不著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；根據腫瘤細胞陽性百分比計分，腫瘤細胞陽性率＜10%計0分，10%～40%計1分，41%～70%計2分，＞70%計3分，按著色強度和腫瘤細胞陽性百分比兩項得分相乘劃分為兩組：陰性為0～4分，陽性表達為6～9分。ALK抗體的表達根據著色的強弱程度判讀：腫瘤細胞存在很強的顆粒狀胞漿染色(任何百分比的陽性腫瘤細胞)為陽性，腫瘤細胞內不存在強顆粒狀胞漿染色為陰性。p53抗體的表達根據著色的強弱程度及百分比判讀：淡黃色或棕黃色強弱不等著色且陽性細胞率＜60%為陰性，棕黃色或棕褐色一致性著色且陽性細胞率＞60%為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman 相關分析；以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組標本中的EGFR、ALK 和p53 表達水平比較 EGFR 在肺腺癌的陽性表達在癌細胞胞膜或漿，呈棕褐色；ALK 在肺腺癌中的陽性表達在癌細胞胞漿，呈顆粒狀的棕褐色強著色；p53在肺腺癌中的陽性表達在細胞核，呈一致性的棕褐色強染色。EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達率均高于肺炎組織，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1和圖1。

2.2 肺癌組織中EGFR、ALK 和p53 的表達與臨床病理特征的關系 EGFR 在肺腺癌組織中的表達與年齡無顯著性相關(P＞0.05)，但與性別、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移顯著相關，在女性、中低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移的肺腺癌組織中EGFR的陽性表達率高于男性、高分化、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期及淋巴結無轉移的肺腺癌組織，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)；ALK 和p53 在肺腺癌組織中的表達與年齡、性別無顯著性相關(P＞0.05)，但與肺腺癌分化程度、臨床分期及淋巴結轉移顯著相關，在中低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴結轉移的肺腺癌組織中，ALK、p53 的陽性表達率高于高分化、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期及淋巴結無轉移的肺腺癌組織，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2～表4。

表1 兩組標本中的EGFR、ALK和p53表達水平比較[例(%)]

圖1 EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達(×100)

表2 EGFR的表達與肺腺癌不同臨床病理特征的關系(例)

表3 ALK的表達與肺腺癌不同臨床病理特征的關系(例)

表4 p53的表達與肺腺癌不同臨床病理特征的關系(例)

2.3 EGFR、ALK和p53在肺腺癌組織中表達的相關性 經Spearman等級相關分析，EGFR和ALK在肺腺癌組織中的表達呈負相關(P＜0.05)。EGFR和p53在肺腺癌組織中的表達呈正相關(P＜0.05)。ALK和p53在肺腺癌組織中的表達呈正相關(P＜0.05)，見表5～表7。

表5 EGFR與ALK在肺腺癌組織中的表達及兩者的相關性(例)

表7 ALK與p53在肺腺癌組織中的表達及兩者的相關性(例)

3 討論

我國的肺癌發病率及死亡率近年來增長較快，且治愈率較低。國內外學者在肺癌的發生發展機制及其藥物治療等方面做了大量研究，表明肺癌的發生發展是一個涉及多因素多因子的復雜過程。找到影響肺癌預后的突變基因，評估這些突變基因對肺癌預后的意義，并針對這些突變基因找到有效的靶向治療藥物十分重要。

EGFR是一個分子量為170 kDa的跨膜糖蛋白，其被配體激活后與許多惡性腫瘤的發生發展及預后密切相關。大量研究表明EGFR的過表達及其基因突變在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、結直腸癌及膠質瘤等腫瘤的發生發展及轉移中發揮重要作用，與腫瘤預后和化療藥物的敏感性相關[11-12]。本實驗結果顯示，在肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達率顯著高于肺炎組織，且與肺腺癌的分化程度、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，在中低分化、臨床分期為中晚期和有淋巴結轉移的肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達率明顯增高。提示EGFR 的表達與肺腺癌的預后關系密切，其陽性表達隨肺腺癌的惡性程度增加而增加，可作為預后不良的參考指標。在不吸煙或少吸煙的女性肺腺癌患者中EGFR基因突變比男性患者更常見。本實驗結果同樣顯示，女性患者肺腺癌組織中EGFR 的陽性表達率明顯高于男性患者，進一步證實了這一結論。

ALK是一種Ⅰ型膜糖蛋白，正常僅在神經系統中低水平表達，當其發生基因重排或基因融合后，與肺非小細胞癌、間變性大細胞淋巴瘤、炎癥性肌纖維母細胞腫瘤等多種腫瘤的發生發展密切相關，被認為是這些腫瘤的主要致瘤驅動基因之一。非小細胞肺癌患者染色體的異位可使ALK基因與EML4基因發生融合，EML4-ALK 融合基因具有催化活性，被認為是導致非小細胞肺癌發生發展的重要原因，且ALK基因與EML4基因發生融合的肺癌患者相較其他分子類型肺癌預后更差[13-15]。p53基因定位于17號染色體，當其發生激活或缺失突變后，變成促進腫瘤發生發展的癌基因，與多種腫瘤的發生發展相關，可作為腫瘤預后的指標之一[16]。有研究顯示，ALK與p53同時突變的肺癌患者比ALK與p53單突變的肺癌患者預后更差[17]。本實驗結果顯示，ALK和p53在肺腺癌組織中的陽性表達率明顯高于肺炎組織，且與患者分化程度、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，在中低分化、臨床分期為中晚期及有淋巴結轉移的肺腺癌組織中ALK 和p53的陽性表達率明顯增高，且ALK 和p53 雙陽性的均為臨床分期為中晚期且有淋巴結轉移的肺腺癌患者，提示ALK 和p53 的陽性表達率會隨著肺癌的嚴重程度增加而增高，揭示ALK 和p53 的表達與肺腺癌的預后轉歸可能正向關聯，且證實了ALK 與p53同時突變的肺癌患者比ALK與p53單突變的肺癌患者預后更差。

對于EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中表達的相關性，目前研究結果不太一致，有研究認為EGFR突變肺腺癌和ALK陽性肺腺癌是兩種相對獨立的、發病機制不同的肺腺癌的分子亞型[18]。本實驗結果顯示，EGFR和ALK在肺腺癌組織中的表達呈負相關，推測EGFR和ALK 可能通過激活不同的信號通路導致肺腺癌的發生發展，兩條通路之間可能具有拮抗作用。EGFR和p53 在肺腺癌中的陽性表達呈正相關，ALK 和p53在肺腺癌中的陽性表達呈正相關。推測EGFR、ALK與p53在肺腺癌的發生發展及轉移中可能具有協同作用，共同促進肺腺癌的發生發展及轉移。

綜上所述，EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中的表達均高于肺炎組織，且與肺腺癌的嚴重程度呈正向關聯，EGFR、ALK 和p53 的陽性表達提示預后不良，在肺腺癌預后評估中具有重要參考價值，且三者的表達具有相關性，可能在肺癌發生發展及轉移過程中相互協同、相互調節。針對這些蛋白的表達評估肺腺癌患者的預后，有選擇性的使用靶向治療藥物，對肺腺癌患者的治療及預后評估具有重要意義。