敲低巨噬細胞移動抑制因子表達對人肺成纖維細胞增殖及遷移能力的影響

羅益鋒 易慧 黃鑫炎 譚衛平 郭禹標 謝燦茂

中山大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，中山大學呼吸病研究所（廣州510080）

間質性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）是一類主要累及肺間質和肺泡腔，導致肺泡-毛細血管功能單位喪失的彌漫性肺疾病，患者往往表現為慢性咳嗽、活動后呼吸困難及進行性加重的低氧血癥，肺功能提示限制性通氣功能障礙伴彌散功能障礙，后期多數都可引起彌漫性肺纖維化，現有的各種治療手段效果欠佳，患者最終出現呼吸功能衰竭而死亡。臨床上如能找到抑制或逆轉肺纖維化的方法，將大大改善間質性肺疾病患者的預后。

纖維化是一類富含膠原的細胞外基質在結締組織中過度積聚、異常交聯，從而影響組織器官正常結構和功能的病理改變。當組織器官局部出現原發炎癥損傷后，機體啟動創傷修復機制，組織細胞、成纖維細胞再生增殖。如在此過程中出現成纖維細胞等過度增殖的情況，即可使細胞外基質生成增多、過度積聚，最終發生纖維化［1-3］。因此，成纖維細胞的激活及過度增殖是纖維化發生發展過程中的重要環節。

巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一個多功能性的細胞因子，除了具有促炎癥、免疫調節作用外，許多研究顯示其還與腫瘤細胞的增殖、轉移，動脈硬化，組織器官纖維化的發生發展等密切相關［4-9］。筆者此前的研究發現MIF 可促進人肺癌細胞H460 的增殖［5］，因此筆者假設MIF 也可促進人肺成纖維細胞的增殖，從而導致肺間質纖維化的發生。近年來有研究報道，MIF 可以促進肥大細胞介導的人皮膚成纖維細胞的增殖、分化，從而加快硬皮病患者皮膚纖維化的進程［10］；另有研究［11］顯示MIF 可促進小鼠成纖維細胞NIH/3T3 細胞的增殖。但MIF 對人肺成纖維細胞增殖及遷移能力的影響如何，國際上尚未報道。

本研究用MIF 抑制慢病毒感染人肺成纖維細胞HFL1，構建MIF 抑制細胞株，觀察敲低MIF 表達后對HFL1 增殖及遷移能力的影響，旨在明確MIF水平下調是否能抑制HFL1 的增殖及遷移能力，減輕肺纖維化的程度，從而為間質性肺疾病患者的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞本實驗所用的人肺成纖維細胞HFL1 購自于廣州賽庫生物技術有限公司。

1.1.2 實驗試劑DMEM 培養基、改良1640 培養基購于美國HyClone 公司；F12-K 培養基、胎牛血清購于美國Gibco 公司；Puromycin 購于美國sigma公司；PLV.I 購于美國SBI 公司；Polybrene 購于美國Santa Cruz 公司；PEI 購于中國輝園苑科技有限公司；高純度總RNA 快速提取試劑盒購于中國BIOTEKE 公司；CCK8 試劑購于中國碧云天科技有限公司；PBS 粉劑購于中國博士德公司；抗青霉素鏈霉素（雙抗）購于中國TBD 公司；trypsin-EDTA 溶液購于中國BIOSHARP 公司；絲裂霉素購于美國Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養HFL1 細胞采用含有10%胎牛血清的F12-K培養基，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養。每隔48 h 更換1 次培養基，待細胞生長至80% ～90%密度時用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代。實驗選用對數生長期細胞。

1.2.2 慢病毒包裝提前1 d鋪3×106/孔293TN細胞于10 cm 平皿；取9 μg PLV.I-MIF 質粒，3 μg pCMV-VSV-G、3 μg pMDLgpRRE、3 μg pRSV-Rev，0.6 mL 無血清DMEM，混合質粒，加入36 μL PEI試劑旋渦離心，室溫孵育15 ～20 min；將轉染試劑和混合物加到293TN 細胞6 h 換液；混合均勻后，放回37 ℃、5%CO2培養箱，感染24、48 及72 h 收集上層液體，室溫下3 000 r/min 離心5 min；取病毒上清分裝到1.5 mL 的EP 管中，放到-80 ℃保存備用。

1.2.3 細胞感染感染前1 d HFL1 細胞鋪6 孔板鋪至80%左右；加入2 mL 病毒上清，2 μg Polybrene及1 mL F12-K 培養基；于37 ℃、5%CO2，繼續培養48 h。感染48 h 后檢測病毒感染效率。

1.2.4 總RNA 提取-逆轉錄-聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）鑒定MIF 抑制細胞株用高純度總RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）提取細胞總RNA并檢測濃度和純度，并根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。qPCR 所用的引物由上海生工生物公司合成，以β-actin 作為內參基因，相關引物序列如下：MIF 上游5′-ATCAGCCCGGACAGGGT-3′和下游5′-ACCGTTTATTTCTCCCCACCAG-3′；β-actin上游5′-TGGCACCAGCACAATGAA-3′ 和下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR 體系：ddH2O 7.4 μL，SYBR 10 μL，cDNA 1 μL，引物1.6 μL。qPCR 反應條件：94 ℃，1 min，40 循環（94 ℃，15 s；60 ℃20 s；72 ℃20 s）。

1.2.5 CCK8 檢測細胞增殖將生長狀態良好的細胞消化下來，將細胞懸液接種到96 孔板中，每孔5 000 個細胞，37 ℃，5%CO2培養箱中預養4、24、48 和72 h。向每孔加入20 μL CCK8 溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h；用酶標儀測定在450 nm 處的光密度。

1.2.6 Woundhealing法檢測細胞遷移先用marker筆在6 孔板背后均勻地劃橫線，大約每隔0.5 ～1 cm 一道，橫穿過孔。每孔至少3 條線。將處于對數生長期的細胞消化下來，制成濃度為1 × 106/mL的細胞懸液均勻接種于6 孔培養板中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中常規培養；細胞均勻鋪滿板底后，用絲裂霉素（4 μg/mL）處理2 h，抑制細胞分裂，用10 μL 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，吸去細胞培養液，用PBS 清洗；加入含絲裂霉素（4 μg/mL）的完全培養基置于培養箱中繼續培養，分別于劃痕后0、24 和30 h 取下室細胞進行拍照；Image Pro-Plus 6.0 軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移距離。細胞遷移能力用遷移率表示，遷移率=（0 h 的劃痕寬度-其他時間點劃痕寬度）/0 h 的劃痕寬度。

1.3 統計學方法數據使用SPSS 22.0 軟件分析，所有數據均表示為均數±標準差。兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，實驗組與對照組相比，P＜0.05 差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MIF 慢病毒成功感染HFL1 細胞本研究應用MIF 抑制慢病毒感染人肺成纖維細胞HFL1，感染48 h 后熒光顯微鏡下觀察細胞感染的效率。結果顯示，MIF 抑制慢病毒感染HFL1 細胞中熒光率達95%以上（圖1）。

2.2 HFL1-sh-MIF 抑制細胞株的qPCR 鑒定設計針對MIF 的3 個抑制靶點，構建細胞株HFL1-sh-MIF-A、HFL1-sh-MIF-B 和HFL1-sh-MIF-C，以HFL1-sh-NC 為對照組，用qPCR 方法檢測MIF mRNA 的表達水平，篩選表達水平最低的細胞株作為實驗組進行后續的研究。結果如表1 和圖2 顯示，與HFL1-sh-NC 相比，細胞株HFL1-sh-MIF-B 的MIF mRNA 表達水平顯著下降（P＜0.001），抑制效率最高。因此篩選出細胞株HFL1-sh-MIF-B 作為后續研究的實驗組細胞株，命名為細胞株HFL1-sh-MIF。

2.3 敲低MIF 抑制HFL1 細胞增殖為了探討敲低MIF 對HFL1 細胞增殖的影響，用CCK8 檢測兩組細胞活力，用酶標儀測定在450 nm 處的OD值來反應細胞增殖情況。結果如表2、圖3所示。4 h時，兩組細胞的OD值差異無統計學意義（P＞0.05）；24、48 和72 h 時，對照組HFL1-sh-NC 的OD值高于實驗組HFL1-sh-MIF，提示HFL1-sh-MIF 細胞株的增殖能力降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 不同細胞株MIF mRNA 的表達水平Tab.1 Quantitative results of mif mRNA expression in the established cell lines

圖2 抑制不同靶點后MIF mRNA 的表達水平Fig.2 MIF mRNA expressionfollowing the inhibition of different targets

表2 不同時間點對照組與實驗組細胞的增殖情況Tab.2 Proliferation of control group and experimental group at different time points ±s

表2 不同時間點對照組與實驗組細胞的增殖情況Tab.2 Proliferation of control group and experimental group at different time points ±s

注：與對照組相比，**P ＜0.01

時間（h）4 24 48 72光密度值對照組（HFL1-sh-NC，n=3）0.083±0.001 0.187±0.002 0.166±0.001 0.196±0.001實驗組（HFL1-sh-MIF，n=3）0.084±0.003 0.105±0.001**0.060±0.000**0.089±0.004**

2.4 敲低MIF 抑制HFL1 細胞遷移能力為了明確敲低MIF 對HFL1 細胞遷移能力的影響，用Woundhealing 法檢測對照組HFL1-sh-NC 及實驗組HFL1-sh-MIF 細胞株的遷移能力，用遷移率反應細胞的遷移能力。24 h 時，實驗組和對照組HFL1 細胞的遷移率差異沒有統計學意義；30 h 時，與對照組相比，實驗組HFL1-sh-MIF 遷移率顯著降低，提示實驗組HFL1-sh-MIF 細胞株的遷移能力降低，差異具有統計學意義。見表3、圖4。

表3 不同時間點對照組與實驗組細胞的遷移率Tab.3 Migration rate of controll group and experimental group at different time points ±s

表3 不同時間點對照組與實驗組細胞的遷移率Tab.3 Migration rate of controll group and experimental group at different time points ±s

注：與對照組相比，##P ＜0.01

組別對照組（HFL1-sh-NC）實驗組（HFL1-sh-MIF）0 h 0 0 24 h 0.522±0.041 0.507±0.027 30 h 0.810±0.023 0.595±0.045##

3 討論

MIF 做為一個多功能性的細胞因子，廣泛參與到人類炎癥、腫瘤、代謝、纖維化等各種疾病的發病機制中。自50 多年前MIF 被發現后，以其作為靶因子進行了許多基礎及臨床醫學的相關研究。常用的針對MIF 進行干預的手段包括使用抗MIF 抗體、MIF 拮抗劑ISO-1 及運用RNA 干擾技術等［5，12-14］。構建shRNA 的慢病毒表達載體是目前較常使用的RNA 干擾技術之一。

慢病毒載體是從二十世紀九十年代發展起來的一種外源性轉基因和基因治療載體。它可以在不導致宿主細胞死亡的條件下在其體內復制，并連續傳代，具有高效的轉染與整合效率。慢病毒載體技術與siRNA 基因沉默技術相結合，在轉基因動物細胞中實現了對特定基因的沉默效應。此外，慢病毒載體能夠將基因治療的基因整合到人的染色體上，使得該基因能夠穩定長期的表達，從而達到治療疾病的目的［15-16］。本研究中，構建針對MIF 特異性的shRNA 慢病毒表達載體，成功應用慢病毒載體感染人肺成纖維細胞HFL1，感染效率高，感染后可顯著敲低HFL1 的MIF 表達水平，與文獻報道相符。

圖4 對照組及實驗組細胞株在不同時間點的遷移情況Fig.4 Migration of controll group and experimental group at different time points

近年來對MIF 的深入研究發現，MIF 與成纖維細胞的增殖密切相關。GU 等［10］以成人皮膚成纖維細胞（HDFa 細胞）為研究對象，觀察外源性重組人MIF 與抗MIF 抗體對HDFa 細胞的影響，結果顯示加入外源性重組人MIF 后，明顯促進了HDFa 細胞的生長及膠原蛋白的合成；加入抗MIF 抗體則可顯著抑制HDFa 細胞的增殖及膠原合成。在另外兩個小鼠成纖維細胞NIH/3T3 和小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的研究中也發現，MIF 有促進成纖維細胞增殖的作用［11，17］。在本研究用CCK8 檢測敲低MIF 表達后對HFL1 增殖的影響，用酶標儀測定在450 nm 處的OD值來反映細胞增殖的情況。結果發現4 h 時，對照組HFL1-sh-NC 和實驗組HFL1-sh-MIF 兩組細胞的OD值沒有顯著差異；24、48 和72 h 時，對照組HFL1-sh-NC 的OD值顯著高于實驗組HFL1-sh-MIF，兩組間差異有統計學意義，表明MIF 表達受抑制后HFL1 的增殖減緩。以上結果提示MIF 對人肺成纖維細胞HFL1 的增殖具有促進作用，與文獻報道的MIF 對其他物種或其他組織來源的成纖維細胞的作用相同。

MIF 對細胞遷移力的影響因細胞種類不同而各異。它可以顯著抑制巨噬細胞的遷移，也因此得名；對中性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞也表現類似的作用，使中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞在局部趨化聚集，分泌和釋放多種炎癥因子及炎癥介質，最終導致局部炎癥發生。對腫瘤細胞，MIF 可以促進其遷移及轉移［18-20］；對血管平滑肌細胞和微血管來源的內皮細胞，MIF 也表現為促進其遷移的作用［21-22］。對成纖維細胞，DEWOR 等［23］在研究中發現，MIF 可以通過Ca 通道途徑激活小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs），促進其遷移，使刮傷皮膚創口的愈合加快。本研究用Woundhealing 法檢測敲低MIF 表達后對人肺成纖維細胞HFL1 遷移能力的影響。實驗中使用含絲裂霉素的細胞培養液抑制細胞增殖，避免因細胞增殖對實驗的影響。結果顯示在24 h 時，實驗組和對照組HFL1細胞的遷移率沒有顯著差異，在30 h 時，與對照組相比，實驗組HFL1 細胞的MIF 表達下調后，其遷移率顯著降低。上述結果提示，MIF 對人肺成纖維細胞HFL1 也表現為促進其遷移的作用，和DEWOR 等［23］報道的MIF 對小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的作用相同。

本研究的主要不足在于未對敲低MIF 表達后抑制HFL1 的增殖及遷移力的相關通路和機制進行深入研究。MITCHELL 等［11］和PETRENKO 等［17］的研究發現MIF 可以通過ERK/MAPKs 信號通路途徑及E2F/p53 信號通路途徑促進成纖維細胞的增殖。此外，有研究提示MIF 可以通過上調Toll 樣受體4（TLR-4）加強脂多糖誘導的滑膜成纖維細胞增殖［24-25］。MIF 對人肺成纖維細胞HFL1 增殖及遷移能力的影響是否也是通過以上通路和機制尚有待進一步實驗驗證。

肺纖維化的主要病理機制為成纖維細胞的異常增殖或凋亡不足以及細胞外基質的過度沉積，而成纖維細胞遷移、活化后轉化為肌成纖維細胞并分泌大量的膠原是細胞外基質的主要成分之一。因此，抑制肺成纖維細胞的遷移、活化和增殖，有助于控制甚至逆轉肺間質纖維化。從本研究的結果看，敲低MIF 表達后對人肺成纖維細胞HFL1 的增殖和遷移能力有顯著的抑制作用，MIF有望成為抗纖維化治療的新靶點。