外泌體介導miR-519c-5p增強脂多糖誘導的血管內皮細胞凋亡作用

黃發 呂嘉賢 許靜紅 姚紀友 童荔 胡曉光 朱艷平曹璐 蔡常潔

1中山大學附屬第一醫院（廣州510080）；2廣東省器官捐獻與移植免疫重點實驗室，廣東省器官移植科技合作基地（廣州510080）；3廣州市第一人民醫院（廣州510000）

膿毒癥是由感染導致的宿主反應失調的威脅生命器官功能障礙［1］。即使在重癥監護室中得到及時的救治，膿毒癥休克引起的病死率仍可達30%～44.3%［2］。目前，越來越多證據顯示，膿毒癥患者即使存活，后期仍會出現其他新發的臨床癥狀，遠期的致殘效果［3］和逐漸惡化的慢性疾病［4］。

目前對于膿毒癥的診斷，主要依靠臨床表現，但特異性較低，相對滯后［1］。外泌體是一種發源于細胞內吞系統中的晚期內體，可由各種類型的細胞分泌，并形成多形性囊泡樣小體，直徑大多介于40 ～150 nm 之間［5-6］。研究發現外泌體中包含大量的蛋白質和RNA，后者包括mRNA、miRNA 和非編碼RNA。這種納米級被膜結構能夠參與細胞間的物質交換和信息交流，在多種生理和病理過程中發揮重要作用［7-8］。同時，外泌體除了能穩定的存在血漿中，還能相對穩定地存在于各種液體中，包括唾液、母乳、腦脊液、腹水等，可以實現快速、無創檢測［9］。通過實時動態監控外泌體的變化，能夠及時有效地輔助確診膿毒癥患者特定的病原體以及判斷目前治療方案是否有效［5］。

目前關于外泌體miRNA 在膿毒癥中的表達情況、作用及其機制的研究仍處于起步階段［10-12］。在本研究的前期，本研究通過膿毒癥患者血漿芯片法發現膿毒癥患者血漿中miR-519c-5p 表達上調［13］。為進一步研究外泌體中miR-519c-5p 的升高對膿毒癥的作用影響及其機制，本實驗通過上調外泌體中miR-519c-5p 表達，驗證了外泌體介導的miR-519c-5p 是能促進脂多糖誘導的血管內皮細胞凋亡，從而在一定程度上預測膿毒癥的病情進展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器超速離心機（Beckman Coulter Optima-XE 100，美國），納米顆粒跟蹤分析儀（Malvern，Nanosight NS 3000，英國），透射電鏡（Hitachi，日本），二氧化碳細胞培養箱（Thermo Scientific Forma，美國），熒光顯微鏡（Leica DMI8，德國），光學顯微鏡（Leica，德國），激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM 710，德國），超純水系統（Merck Millipore，德國），450 型自動酶標儀系統（SunriseTM，瑞士），流式細胞儀（CytoFLEX，美國）。

1.1.2 主要試劑脂多糖（Sigma，美國），Cell Counting Kit-8（Dojindo，日本），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Solarbio，中國），蛋白抗體（Abcam，英國），has-miR-519c-5p 及u6 q RT-PCR 引物、陰性對照（negativecontrol，NC）、MicrONTMCy3-hasmiR-519c-5p 模擬物（mimic）及其NC 為銳博公司產品，miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，中國），SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa），cDNA 試劑盒（Thermo Scientific，美國），TRIzolTMRegent（Thermo Scientific，美國），Dr.GenTLETMPrecipitation Carrier（Takara#9094，日本），PKH 67（Sigma，美國），DAPI（鼎國，中國）。

1.2 細胞培養人臍帶靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購 于 美 國ScienCell 研究室。HUVECs 細胞株培養液為ECM基礎培養基+5%胎牛血清（4 ℃，超速120 000 ×g離心18 h 去除胎牛血清中外泌體）+1%青鏈霉素+1%生長因子，5%CO2，37 ℃培養箱中培養。每2 ～3 d 傳代1 次。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。種板時取對數生長期的HUVECs 細胞，0.25%胰酶制成單個細胞懸液，細胞濃度為1 × 105/mL，根據實驗需求鋪于6 孔板（每孔2 mL）或96 孔板（每孔100 μL），培養24 h 待其貼壁后饑餓處理再行后續實驗。

1.3 實驗細胞分組細胞接種于6 孔板或96 孔板24 h 后經饑餓處理后，分為空白組：HUVECs +blank-exosomes 組；對照組：HUVECs+ LPS +blankexosomes組，HUVECs+miR-519c-5p-exosomes組；實驗組：HUVECs+ LPS + miR-519c-5p-exosomes 組。對于需要LPS 刺激的細胞：加入終濃度為10 μg/mL的LPS或者等量的PBS共同孵育6 h終止后換液［14］，對于需要外泌體刺激的細胞：加入2 μg 經BCA 測定濃度的外泌體或者等量體積的PBS 與細胞濃度為1×105/mL 共同孵育12 h［15］。

1.4 外泌體

1.4.1 外泌體收集取培養48 ～72 h 的HUVECs，收集培養瓶中的培養基，收集完畢后將培養瓶中的HUVECs 繼續培養基培養，傳代。將收集好的的培養基放入離心管中，4 ℃2 000 ×g離心30 min以去除培養基中的細胞和細胞碎片等。將離心好的不含細胞和碎片的培養基移入超速離心管，并放入超速離心機中，注意不要碰到原離心管底部的離心沉淀物，以4 ℃，高速16 800 ×g離心30 min以去除微小顆粒，將予以離心好的培養基予以0.22 μm 濾膜過濾。過濾完后放置移入新的超速離心管，放入超速離心機中，以4 ℃，超速100 000 ～120 000×g離心70 min，去除上清，注意不要把底部沉淀吸走。超速離心管中加入適量PBS 充分混勻溶解沉淀后重復4 ℃，超速100 000 ～120 000×g離心70 min，最后予以50～100 μL PBS 吹打離心管底部的外泌體，使其充分溶解溶解沉淀的外泌體。4 ℃保存備用。長期保存時置于-80 ℃［16］。

1.4.2 外泌體形態鑒定取出在-80 ℃冰箱保存的外泌體，放置于冰水混合物中解凍。取濃度為0.5 mg/mL的外泌體10 μL滴加于銅網上沉淀1 min，濾紙吸去浮液。然后醋酸雙氧鈾負染1 min，濾紙吸掉多余液體。常溫干燥15 min，上機，80～120 kV 成像。

1.4.3 外泌體粒徑鑒定使用Nanosight NS3000 測量樣品粒徑前，先予以超純水緩慢推注，清洗檢測管路及測試板，并將管路及測試板中的氣泡予以去除。將濃度為0.5 mg/mL 的外泌體樣品1∶1 000稀釋于標準PBS 中成1～2 mL，使用1 mL 注射器取1 mL 稀釋后的樣品緩慢注入檢測管路中，讓樣品勻速通過檢測管路。在軟件可見比較均勻的顆粒通過時，即可以實施檢測。NTA 軟件即開始紀錄每一個顆粒的布朗運動，并對于每個顆粒自動定位，跟蹤其中心運動的軌跡，計算平均唯一，繪制出顆粒散射光強-粒徑-數量分布的三維圖，NTA 軟件可計算出顆粒粒徑的數量分布信息。

1.4.4 Western Blot取出在-80 ℃冰箱保存的外泌體，并采用BCA 法測量外泌體濃度，取20 μg 外泌體樣品+等體積SDS samplebuffer，煮沸5 min。根據待測蛋白分子量的大小（CD63 預測分子量大小26 kDa，TSG101 預測分子量大小44 kDa）選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜電轉，封閉完孵育一抗4 ℃過夜，根據說明書推薦配制一抗濃度：CD63（1∶1 000）、TSG101（1∶1 000）；PBST洗膜后孵育二抗1 h，再洗膜。ECL 化學發光液顯色后于化學發光成像儀器中曝光。

1.4.5 外泌體轉染超速離心后所得外泌體沉淀，予以50～100 μL PBS 重懸后，BCA 法測量外泌體蛋白濃度，將200 pmol miR-519c-5pmimic 或者mimicNC 與20 μg 外泌體在無菌PBS 中混合，然后加入CaCl2（終濃度0.1 mol/L）。使用無菌PBS 將最終體積調節至300 μL。將混合物再置于冰上5 min。最后再次4 ℃，超速120 000×g離心70 min 分離外泌體［17］。

1.4.6 細胞攝取外泌體實驗超速離心后所得的外泌體沉淀，重懸于0.5 mL Diluent C 中，同時將4 μL PKH 67 添加至0.5 mL Diluent C 中，兩者混勻，常溫避光孵育4 min。隨后添加2 mL 0.5%BSA 以終止過度染色，將標記的外泌體再次超速離心1 h 以清楚殘余燃料，隨后外泌體沉淀重懸于200 μL PBS 中。將標記好后的外泌體添加到受體細胞中（共聚焦培養皿，20 μg/mL），37 ℃孵育8 h。吸去細胞上清夜，用PBS 洗1 次，加入固定液，避光孵育10 min，吸去固定液，用PBS 洗2 次，每次2 min，手搖或者搖床震蕩。加入1 mL DAPI（染細胞核），避光孵育5 min。吸去DAPI，用PBS 洗3次，每次2 min，手搖或者搖床震蕩。最后在共聚焦皿中加入1 mL PBS，避光保存，立即予以上共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取外泌體熒光顯色情況。

1.5 實時熒光定量PCR 法使用Trizol 提取細胞與外泌體總RNA，在提取外泌體總RNA 時，需加入Takara#9094 助沉劑，后按照說明書進行實時熒光定量PCR 法，后續PCR 條件為95 ℃30 s；40 個PCR循環（95 ℃5 s；60 ℃30 s），反應總體積20 μL。以u6 作為內參。引物序列如下示：

miR-519c-5p（Forward Primer（5′-3′）GTCACCGGGTGTAAATCAG）、（Reverse Primer（5′-3′）GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAG）；u6（Forward Primer（5′-3′）CTCGCTTCGGCAGCACA）、（Reverse Primer（5′-3′）AACGCTTCACGAATTTGCGT）。

1.6 CCK-8 法檢測各實驗組HUVECs 的活力96 孔板中每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1 h 后在酶標儀450 nm 波長下檢測各孔吸光度，以OD值反映細胞增殖情況。

1.7 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測各實驗組HUVECs的凋亡率使用0.25%不含EDTA 的胰酶消化6 孔板內的HUVECs，室溫下1 000 r/min 離心5 min，棄上清液。將細胞沉淀重懸在1 mL bindingbuffer 中，37 ℃孵育10 min，室溫下1 000 r/min 離心5 min，去上清。將細胞重懸在100 μL bindingbuffer 中，按照說明書加入適量染色劑Annexin V/PI，室溫避光孵育15 min 后加入400 μL bindingbuffer，于1 h 內上機檢測。

1.8 統計學方法實驗數據分析均采用SPSS 21.0 統計軟件處理。兩組數據間比較，數據呈正態分布且方差其的數據采用t檢驗；呈正態分布但方差不齊的數據采用校正t檢驗。多組件比較數據呈正態分布且方差齊，采用完全隨機設計的方差分析，組間比較分析采用Dunnettt 檢驗。其中P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體粒徑分布在（158.9 ± 36.4）nm 左右并表達CD63、TSG101收集細胞培養基，利用超速離心法提取外泌體，透射電鏡鑒定所得外泌體形態（圖1A）。透射電鏡鑒定外泌體形態上均呈現雙層膜茶托樣結構。Nanosight NS3000 結果表明收集得外泌體粒徑分布集中于（158.9±36.4）nm 左右（圖1B），顆粒濃度在107/mL，具體產量隨細胞狀態，培養時間及純化分析方式不同有較大波動。同時，Western Blot 顯示收集得外泌體均表達常見外泌體標記蛋白CD63、TSG101（圖1C）。

圖1 外泌體鑒定Fig.1 The identification of exosomes

2.2 轉染組外泌體miR-519c-5p 以及攝取外泌體的內皮細胞的miR-519c-5p 表達量升高qRTPCR 結果（圖2）顯示：空白組的外泌體幾乎不表達miR-519c-5p，而轉染miR-519c-5p mimic 的外泌體組能穩定高表達miR-519c-5p（P＜0.001）；同時，穩定高表達miR-519c-5p 的外泌體與各組HUVECs共培養后，同樣均高表達miR-519c-5p（P＜0.001）。

圖2 轉染后的外泌體和與轉染后的外泌體共培養的細胞過表達miR-519c-5pFig.2 MiR-519c-5p was overexpressed in transfected exosomes and in the cells co-cultured with the transfected exosomes

2.3 HUVECs 攝取過表達miR-519c-5p 的外泌體激光共聚焦結果顯示（圖3）HUVECs 中既有綠色熒光標記的外泌體，又有紅色熒光標記的miR-519c-5p，兩者重疊的時候為黃色，這直觀的表明外泌體可將miR-519c-5p 運送至HUVECs 中。

2.4 過表達miR-519c-5p 的外泌體能夠抑制HUVECs 增殖空白組培養12 h 后平均OD值為（1.388±0.03）；對照組在培養12 h 后平均OD值為（0.843±0.04）；實驗組在培養12 h 后平均OD值為（0.458 ± 0.01）；可見實驗組OD值最低（0.458vs.0.843，P=0.048；0.458vs.1.388，P＜0.001），對照組OD值同時亦低于空白組（0.843vs.1.388，P=0.048），見圖4。

2.5 過表達miR-519c-5p 外泌體增加HUVECs 凋亡空白組平均凋亡率（0.647 ± 0.04）%，對照組HUVECs + LPS + blank-exosomes 平均凋亡率為（3.517 ± 0.61）%，對照組HUVECs + miR-519c-5pexosomes的平均凋亡率為（3.33±0.135）%，對照組間平均凋亡率差異無統計學意義（3.517%vs.3.33%，P= 0.104），兩組對照組平均凋亡率為（3.423 ±0.75）%，實驗組平均凋亡率為（7.197 ± 0.16）%。實驗組HUVECs 平均凋亡率比空白組、對照組的高（7.197%vs.0.647%，P＜0.001；7.197%vs.3.423%，P= 0.001），空白組HUVECs 凋亡率比對照組的低（0.647%vs.3.423%，P=0.001），實驗組的HUVECs的平均凋亡率最高，見圖5。

3 討論

膿毒癥一直是重癥醫學領域的重點和難點。如果膿毒癥患者不能得到及時和有效的救治，將會引起多器官的功能損傷，短期時間內發展成多器官功能衰竭，最后死亡。 有研究表明，膿毒癥的根本原因是機體對外部損傷的過度反應障礙，這是膿毒癥導致遠處器官損傷的根本原因［18］。因此，揭示膿毒癥的形成機制，做到盡早預警膿毒是非常重要的。目前為止，膿毒癥治療指南已經更新至第三版，但仍未尋找到能直接監測由膿毒癥引起的組織損傷或者能預測隨后發生的臟器功能衰竭分子生物學標志物［1，19-20］。目前的膿毒癥標志物，如乳酸和降鈣素原也許能夠明確是否出現組織灌注不足或者發生臟器功能衰竭，但并不能很好地運用于抗生素的調整使用［21］。早期的研究表明膿毒癥當中miRNA 具有促進炎癥或免疫反應的作用［22］，像miR-26a-5p、miR-339-5p 能夠抑制核內κB 因子的表達［23-24］，miR-185-5p 能調節免疫細胞的增殖和分化［25］。miRNA 在常態下極易分解，但在人體血漿中，miRNA 經常通過以下途徑來保持其穩定：（1）與高密度脂蛋白結合；（2）與argonaute 蛋白結合；（3）裝載入保護性囊泡如外泌體［26］。在近十年的研究中，發現外泌體在腫瘤發生發展中起著介導細胞與細胞間交流信息的重要作用，并且對于腫瘤微環境的形成以及腫瘤細胞的免疫逃逸起著重要的幫兇作用［27］。外泌體的釋放代表一種即時的細胞通訊機制，可以實現3 個主要功能：（1）將表達模式轉移至其他細胞；（2）在液相內分散膜結合介體；（3）以及細胞表明快速重排［5］。外泌體可立即以旁分泌方式修飾鄰近的細胞表型，但也可以通過將膜成分和（或）表達方式轉移至循環的其他區域。目前有文獻表明，外泌體監測能有效的幫助鑒定和表征給膿毒癥患者特定的病理生理學，以及評估患者可用的各種治療方案的功效。同時，外泌體也是理想的載藥系統，通過外泌體介導的藥物能夠有效的傳送至靶點啟動治療效果［28］。

圖3 激光共聚焦鏡下血管內皮細胞Fig.3 HUVECs in laser confocus microscope

圖4 不同分組的HUVECs 增值活性檢測結果Fig.4 Proliferative activity in different groups of HUVECs

圖5 不同分組HUVECs 凋亡檢測流式結果以及結果定量分析圖Fig.5 Flow cytometry resultsand quantitative analysis of apoptosis detection in different groups

本研究中，通過LPS 誘導HUVECs 構建膿毒癥細胞模型，將通過轉染miR-519c-5pmimic 得到過表達miR-519c-5p 的外泌體與之共培養，共培養后的HUVECs 的通過CCK8 法與流式細胞術檢測其增殖能力與凋亡情況。結果顯示過表達的miR-519c-5p 外泌體能夠促進LPS 誘導的HUVECs 增殖能力下降，凋亡增多。目前對于外泌體高表達miR-519c-5p 能促進脂多糖誘導的HUVECs 凋亡的機制并不清楚，并且對于miR-519c-5p 在膿毒癥中發揮的作用也不清楚。目前研究表明miR-519c 家族可能與RNA 結合蛋白HuR 有關［29］。miR-519 靶向結合HuR mRNA 并抑制其翻譯，顯示了一種轉錄后調節因子（miRNA）對另一種轉錄后調節因子（RNA 結合蛋白）的調節作用。與大多數miRNA與目標mRNA 的3′-UTR 相互作用不同，miR-519 似乎主要通過與HuRmRNA 的編碼區（CR）結合起作用。RNA 結合蛋白（RBPs）是哺乳動物細胞中基因表達的關鍵調節劑。它們影響基因表達的關鍵，包括mRNA 剪接、5′加帽、3′聚腺苷酸化、核轉運、細胞質運輸、儲存、翻譯和周轉［30］。而HuR 是影響細胞對應激物、增殖信號、抗凋亡、免疫觸發和發育線索的細胞響應的最突出的特異性RBPs［31］。HuR 的靶標還包括編碼促進增值和血管生存的蛋白質mRNA，以及增強細胞逃避衰老，凋亡和免疫系統的蛋白質［32］。miR-519 能抑制HuR 表達，降低HuR 翻譯，同時通過減少HuR 蛋白水平間接降低HuR 靶向mRNA，而這些mRNA 大多編碼增值蛋白，如細胞周期蛋白，生長因子（IGF-1R VEGF、EGF、TGF-β等），促有絲分裂和轉錄因子（c-fos、cmyc、c-jun、p53 等）的表達［33］，從而使細胞凋亡增加。miR-519c-5p 在外泌體中的高表達在對細胞的確切機制以及對膿毒癥狀態下的細胞凋亡調控機制和進展仍有待于進一步的研究。

綜上所述，外泌體介導的miR-519c-5p 也許通過調節RNA 結合蛋白HuR 從而影響細胞的增殖與凋亡。前期的研究發現［13］，血漿中miR-519c-5p升高的膿毒癥與膿毒癥休克患者病死率增高存在正相關，可以通過收集患者的液體比如唾液，腹腔積液，進行外泌體分離提純，并檢測miR 表達譜，如miR-519c-5p，最終輔助評估患者病情，指導臨床治療，攻克膿毒癥診治難關。