姜黃素通過(guò)TLR-4/NF-κB信號(hào)通路減輕膿毒癥相關(guān)的急性腸損傷

張永虎 張丹霞 曾良

1南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科（湖南衡陽(yáng)421001）；2衡陽(yáng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科（湖南衡陽(yáng)421001）

膿毒癥（sepsis）是一種主要由感染因素誘發(fā)、以炎癥系統(tǒng)過(guò)度激活為主要病理特征的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導(dǎo)致多器官功能衰竭，是重癥醫(yī)學(xué)科最常見(jiàn)的疾病［1］。眾所周知，胃腸道是多器官功能障礙綜合征的始動(dòng)器官。研究表明［2］，膿毒癥可以造成小腸黏膜上皮細(xì)胞損傷以及細(xì)胞間連接斷裂，從而導(dǎo)致腸屏障功能受損、腸道通透性增加。近年來(lái)，中醫(yī)中藥治療膿毒癥備受關(guān)注，且具有一定的療效，但大多數(shù)都缺乏或未完全闡明其具體作用機(jī)制。姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物根莖中提取出的一種天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抗微生物等多方面的藥理作用［3］。有報(bào)道稱［4］，姜黃素可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥。也有研究顯示，姜黃素對(duì)腸道炎癥性疾病有一定的改善作用［5］。然而，姜黃素是否可改善膿毒癥所致腸損傷，目前鮮有報(bào)道。此外，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是炎癥起始的核心調(diào)控因子，不少中藥材可通過(guò)抑制NF-κB 通路活化達(dá)到抗炎效果［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用姜黃素預(yù)處理膿毒癥大鼠，探討其是否可通過(guò)調(diào)控TLR-4/NF-κB 通路對(duì)膿毒癥大鼠所致腸損傷發(fā)揮保護(hù)作用，旨為臨床治療膿毒癥相關(guān)急性腸損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD 大鼠100只，鼠齡6 ～7周，體質(zhì)量（260±20）g，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（鄂）2018-0018。溫度為24℃，濕度為50%，12 h 明暗交替，術(shù)前禁食12 h，不禁水。

1.2 主要試劑及儀器姜黃素（純度≥98%）購(gòu)買于上海阿拉丁公司；蘇木素、伊紅購(gòu)于上海碧云天生物公司；中性樹(shù)脂購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司；一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D 公司；Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65（Ser536）、NF-κB p65 抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；正置顯微鏡、石蠟切片、攤片機(jī)購(gòu)于徠克顯微系統(tǒng)有限公司；石蠟包埋機(jī)購(gòu)于湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自Beckman Coulter 公司；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Science 公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物造模及分組處理100 只雄性SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成兩批，每批分4 組，即假手術(shù)組（sham）、模型組（Model）、姜黃素低劑量組（L-Cur，50 mg/kg）、姜黃素高劑量組（HCur，200 mg/kg）。第一批大鼠用于術(shù)后24 h 組織及血液樣本收集，每組10 只；第二批大鼠用于術(shù)后72 h 生存率統(tǒng)計(jì)，每組15 只。3%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥大鼠模型［7］，假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行相同開(kāi)腹手術(shù)操作，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔。藥物組于造模前24 h 采用十二指腸插管給藥方式給予不同濃度姜黃素處理，低劑量組劑量為50 mg/kg，高劑量組劑量為200 mg/kg，假手術(shù)組和膿毒癥組注射等量生理鹽水。

1.3.2 取材及存活率統(tǒng)計(jì)第一批大鼠于術(shù)后24 h 采用摘眼球取血法取血，4℃下10 000×g 離心10 min，取上清保存?zhèn)溆茫浑S后斷頸處死各組大鼠，取小腸組織保存?zhèn)溆?。第二批大鼠從術(shù)后即刻開(kāi)始，每隔5 h 統(tǒng)計(jì)1 次各組大鼠死亡情況，72 h為終末觀察點(diǎn)。

1.3.3 HE 染色觀察小腸組織病理變化取小腸組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h 后脫水處理，常規(guī)石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察病理改變，采用Chui′s 評(píng)分［8］評(píng)價(jià)腸損傷情況。

1.3.4 ELISA 檢測(cè)血清中炎癥因子取各組大鼠血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.3.5 小腸組織中NO、MDA含量及SOD活性檢測(cè)取小腸組織稱質(zhì)量，碾磨至勻漿，4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清液。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑，孵育后測(cè)各樣品吸光度值，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算公式分別計(jì)算NO、MDA含量及SOD 活性。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)小腸組織中Claudin-1、ZO-1及TLR-4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)取各組大鼠小腸組織稱質(zhì)量后加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000×g離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1、ZO-1、TLR-4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（Ser536）抗體和β-actin 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑曝光顯影，在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白與β-actin 灰度值比表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用Log-rank Test 進(jìn)行生存曲線間比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠存活率的影響對(duì)各組大鼠術(shù)后72 h 內(nèi)存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Kaplan-Meier分析顯示，Model 組大鼠中位生存期為45 h，L-Cur組大鼠中位生存期50 h，H-Cur 組大鼠中位生存期為65 h。Log-rank Test 分析顯示，H-Cur 組大鼠72 h 生存率顯著高于Model 組（P＜0.05），而L-Cur組與Model組比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后72 h 生存曲線Fig.1 Survival curve of rats in each group at 72 h after operation

2.2 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠小腸組織病理結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖2A，sham 組大鼠小腸顯示正常腸絨毛結(jié)構(gòu)，排列規(guī)則，無(wú)充血及斷裂現(xiàn)象；Model 組大鼠小腸可見(jiàn)絨毛短細(xì)，排列紊亂，黏膜下及基層血管充血明顯，表現(xiàn)出淤血及出血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；L-Cur 組大鼠小腸絨毛短細(xì)，排列紊亂，上皮下間隙擴(kuò)張，伴隨黏膜上皮層與固有層的中度分離；H-Cur 組大鼠小腸可見(jiàn)腸絨毛排列尚規(guī)則，連續(xù)性完整，輕度充血伴上皮輕度抬高，出現(xiàn)輕度的上皮下間隙。見(jiàn)圖2B，與sham 組比較，Model 組Chui′s評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與Model 組比較，L-Cur組Chui′s 評(píng)分無(wú)顯著變化（P＞0.05），H-Cur 組Chui′s 評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠小腸組織切片病理觀察（HE 染色，×200）Fig.2 Pathological changes of small intestine tissue sections（HE staining，×200）

2.3 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響見(jiàn)圖3，與sham 比較，Model 組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加（P＜0.05）；與Model 組比較，H-Cur 組血清中炎癥因子含量均顯著降低（P＜0.05），而L-Cur 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠小腸組織中氧化應(yīng)激水平的影響見(jiàn)圖4，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中NO 水平、MDA 含量顯著增加（P＜0.05），SOD 活性顯著下降（P＜0.05）；與Model 組比較，H-Cur 組大鼠小腸組織中NO 水平、MDA 含量顯著降低（P＜0.05），SOD 活性顯著增加（P＜0.05），而L-Cur 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠血清炎癥因子含量的影響Fig.3 Effects of Cur on serum inflammatory cytokines in sepsis rats

圖4 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織中NO 水平、SOD 活性及MDA 含量的影響Fig.4 Effects of Cur on the NO level，SOD activity and MDA content in intestinal tissues of sepsis rats

2.5 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠小腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表達(dá)的影響見(jiàn)圖5，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中Claudin-1和ZO-1 蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）；與Model組比較，H-Cur 組大鼠小腸組織中Claudin-1、ZO-1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），而L-Cur 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 姜黃素對(duì)膿毒癥模型大鼠TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的影響見(jiàn)圖6，與sham 組比較，Model 組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均顯著上升（P＜0.05）；與Model 組比較H-Cur 組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65（Ser536）水平均顯著上升（P＜0.05），而L-Cur 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒癥是基于感染因素介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），在病程中表現(xiàn)為機(jī)體和病原體相互作用導(dǎo)致的促炎和抗炎反應(yīng)失衡，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、全身炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)等［9-10］。在國(guó)內(nèi)，運(yùn)用中醫(yī)藥防治膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）已成為一個(gè)重要的發(fā)展方向。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量姜黃素干預(yù)可顯著降低膿毒癥大鼠血清炎癥反應(yīng)和小腸組織氧化應(yīng)激水平，并促進(jìn)小腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1 和ZO-1 表達(dá)，抑制TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而提高膿毒癥大鼠生存率，改善腸黏膜損傷，表明姜黃素可能通過(guò)調(diào)控TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路改善膿毒癥模型大鼠急性腸損傷。

圖5 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織中Claudin-1 和ZO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Cur on the proteins expression of Claudin-1 and ZO-1 in intestinal tissues of sepsis rats

圖6 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠小腸組織中TLR-4、MyD88、NF-κB p65 和p-NF-κB p65（Ser536）蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Cur on the proteins expression of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65（Ser536）in intestinal tissues of sepsis rats

CLP 是制備膿毒癥動(dòng)物模型的金標(biāo)準(zhǔn)，其中穿孔處溢出的糞便可造成腹腔感染，同時(shí)缺血壞死的結(jié)扎段盲腸還可以誘導(dǎo)大量炎癥因子的釋放，進(jìn)而形成SIRS［11］。有研究顯示［12-13］，采用CLP法制備膿毒癥大鼠模型，可于術(shù)后12、24 h 即可檢測(cè)到大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平顯著增高。本研究結(jié)果也顯示，術(shù)后24 h 模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β含量均顯著上升，然而采用高劑量姜黃素干預(yù)可顯著降低膿毒癥大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β等含量，說(shuō)明姜黃素可降低毒癥大鼠血清炎癥水平，與SILVA 等［14］研究一致。然而，姜黃素是否可改善膿毒癥所致急性腸損傷目前尚未明確。

有研究表明［15］，腸屏障功能障礙是導(dǎo)致膿毒癥多器官衰竭的主要原因之一。膿毒癥時(shí)，大量炎癥因子的刺激下iNOS 被誘導(dǎo)表達(dá)并在腸道內(nèi)大量合成NO，同時(shí)被激活的中性粒細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞將會(huì)釋放出大量活性氧簇，造成腸黏膜氧化損傷，引起腸道屏障功能障礙和腸通透性增加，從而導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物以及其他腔內(nèi)內(nèi)容物的移位，直接或間接導(dǎo)致遠(yuǎn)處組織損傷或炎癥［16］。而姜黃素具有天然的強(qiáng)抗氧化能力，不僅能夠抑制氧自由基的生產(chǎn)，還能夠清除氧自由基以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠小腸組織損傷嚴(yán)重，且NO 水平和MDA含量顯著增加，而SOD 活性顯著降低，說(shuō)明膿毒癥模型大鼠小腸組織確實(shí)存在較高水平的氧化損傷。然而，高劑量姜黃素干預(yù)可改善膿毒癥大鼠小腸組織損傷，并降低小腸組織NO 水平和MDA含量，提高SOD 活性。說(shuō)明姜黃素可降低膿毒癥大鼠小腸組織氧化損傷。OUYANG 等［18］研究也顯示，姜黃素可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷改善腸黏膜損傷。此外，正常腸道屏障主要由腸上皮細(xì)胞間連接形成的機(jī)械屏障和腸道內(nèi)菌群平衡組成的生物免疫屏障等共同構(gòu)成，能夠有效阻止腸道內(nèi)菌群及內(nèi)毒素等有害物透過(guò)腸黏膜進(jìn)入血液。腸道上皮細(xì)胞間緊密連接主要是由跨膜蛋白Claudin 和緊密連接蛋白ZO-1 組成的復(fù)合體，位于細(xì)胞間連接的最頂端，組成了腸上皮下基質(zhì)與腸腔間的第一道機(jī)械屏障［19］。大量研究顯示［10，20］，發(fā)生腸屏障功能障礙時(shí)，Claudin 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠小腸組織中Claudin 和ZO-1 蛋白表達(dá)量下降，而高劑量姜黃素干預(yù)后可顯著上調(diào)小腸組織中Claudin和ZO-1 的表達(dá)。表明，姜黃素可改善膿毒癥大鼠腸屏障功能障礙。

TLR4/NF-kB 通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路，在炎癥反應(yīng)中TLR4 觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，經(jīng)髓樣分化因子88（MyD88）激活NF-κB 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)［21］。ZHAN 等［22］研究顯示，在膿毒癥誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙大鼠腸組織中NF-κB 通路被顯著激活。而多項(xiàng)研究［23-24］表明，姜黃素可以阻斷TLR4/NF-kB 通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，姜黃素是否通過(guò)該通路發(fā)揮改善膿毒癥相關(guān)急性腸損傷還未知。本研究中結(jié)果顯示，模型組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均顯著增加，表明，膿毒癥大鼠小腸組織TLR4/NF-kB 通路被顯著激活。而采用高劑量姜黃素干預(yù)后膿毒癥大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及磷酸化NF-κB 水平均顯著下降，說(shuō)明姜黃素可能是通過(guò)阻斷TLR4/NF-kB 信號(hào)通路，從而發(fā)揮減少膿毒癥相關(guān)的急性腸損傷作用。

綜上所述，姜黃素可以通過(guò)抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低膿毒癥大鼠血清炎癥反應(yīng)以及小腸組織氧化損傷，從而改善大鼠膿毒癥相關(guān)的急性腸損傷。本研究確定了姜黃素減輕膿毒癥相關(guān)的急性腸損傷的作用通路，但是具體的作用靶點(diǎn)未予涉及，需要后續(xù)的進(jìn)一步研究。