縫隙連接蛋白43基因多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關性研究

李俊彥 何來鵬 陸冰 葉劍 李友

廣東醫科大學附屬醫院老年醫學中心（廣東湛江524001）

缺血性腦梗死約占腦卒中70% ～80%，其中TOAST 分型中的大動脈粥樣硬化型腦梗死（atherosclerotic cerebral infarction，ACI）是缺血性腦梗死常見類型［1-2］。ACI 最根本的病因是動脈粥樣硬化，而各細胞之間縫隙連接的直接通訊失調是引起動脈粥樣硬化的重要環節［3］。

許多研究表明，縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）分布于人體的各種細胞與組織中，尤其是中樞神經系統，其參與內皮細胞損傷后修復、內環境穩態及細胞新陳代謝等病理生理過程，特別與腦缺血密切相關［4-7］。近年來，一些動物研究發現Cx43 的異常表達與腦缺血再灌注損傷有關［8-10］。此外，CHEN 等［11］研究發現Cx43 的異常表達通過影響腫瘤壞死因子-α、白介素-6 及干擾素-γ等炎癥因子的表達，參與神經炎癥和大動脈粥樣硬化的病理生理過程，進而導致急性缺血性腦梗死的發生。加拿大學者FREITAS-ANDRADE 等［12］報道了急性缺血性腦梗死小鼠腦核心壞死區的Cx43表達水平于缺血3 h 后逐漸降低，提示過表達Cx43可作為治療早期急性缺血性腦梗死的潛在機制。

近年來，一些研究發現Cx43 基因多態性與心房纖顫、房間隔缺損及法洛四聯癥等心臟相關疾病易感性有關［13-15］。此外，GU 等［15］報道了Cx43 基因啟動子區rs2071166 位點多態性可影響其啟動子轉錄活性，進而引起Cx43 基因mRNA 表達異常。迄今為止，從分子遺傳學角度研究Cx43 基因多態性與ACI 易感性的關系尚未見國內外研究報道?；诖?，本研究以廣東漢族人群為研究對象，分析Cx43 基因啟動子區rs2071166 多態性位點與ACI 易感性的關系，并進一步研究ACI 患者外周血Cx43基因mRNA 表達水平的變化以及rs2071166 位點多態性對Cx43 基因mRNA 表達水平的影響，為進一步闡明Cx43 基因多態性與ACI 易感性的關系提供強有力的分子流行病學依據，為ACI 的診治打下理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年1月至2018年12月在廣東醫科大學附屬醫院老年醫學中心住院的初發的ACI 患者（病例組）300 例，所有患者均經頭部磁共振檢查確診，根據TOAST 分型歸類為ACI，并剔除既往有其他類型的腦梗死或腦出血病史患者。對照組來源于我院健康體檢中心同期進行體檢的健康者300 例。所有研究對象均為廣東漢族人群，并且相互之間無血緣關系。本次研究已通過廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會審核，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組的性別、年齡分別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 病例組和對照組的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

表1 病例組和對照組的臨床資料比較Tab.1 The comparison of clinical data between the case group and control group ±s

注：CHOL，總膽固醇；TG，甘油三脂；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白

臨床資料年齡（歲）性別（男/女，例）吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］高血壓病史［例（%）］2型糖尿病史［例（%）］空腹血糖（mmol/L）CHOL（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）病例組（n=300）68.15±10.35 187/113 185（61.7）116（38.7）181（60.3）108（36.0）6.78±1.35 5.14±1.24 2.07±0.99 1.35±0.34 3.12±1.13對照組（n=300）67.67±10.14 174/126 92（30.7）94（31.3）85（28.3）25（8.3）5.52±1.19 4.89±1.16 1.85±0.86 1.48±0.42 2.82±1.02 t/χ2值0.574 1.175 58.001 3.546 62.239 66.549 12.13 2.550 2.906 4.167 3.413 P值0.566 0.278＜0.001 0.060＜0.001＜0.001＜0.001 0.011 0.004＜0.001＜0.001

1.2 基因型檢測抽取所有研究對象空腹外周靜脈血2 mL，收集于枸櫞酸鈉抗凝管，采用QIAamp DNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司）抽提基因組DNA。運用SNaPshot 技術［16］（Applied Biosystems，USA）分別對300 例病例組和300 例對照組的Cx43基因啟動子區rs2071166 多態性位點進行基因型檢測，主要操作過程包括：PCR 反應、單堿基延伸反應和基因多態性位點序列測定，PCR 上游引物序列：5′-ATCTCCACCATTCCCTTTGTTA-3′；下游引物序列：5′-TGGGGAAGCATATAACCAGTTC-3′。

1.3 外周血單個核細胞總RNA 提取和熒光定量PCR隨機選取30 例對照組和30 例病例組，按照密度梯度離心法和TRIzol 法分別提取兩組外周血單個核細胞和單個核細胞總RNA。根據cDNA 反轉錄試劑盒（Thermal Scientificx）的操作步驟將單個核細胞總RNA 反轉錄為cDNA。采用熒光定量PCR 方法測定兩組外周血單個核細胞Cx43 mRNA相對表達量。Cx43 基因上游引物序列：5′-CAGCTTGTACCCAGGAGGAG-3′，Cx43 基因下游引物序列：5′-TGTCCCTGGCCTTGAATATC-3′；GAPDH 基因上游引物序列：5′-CACCAGGTGGTCTCCTCTGAC-3′，GAPDH 基 因 下游 引 物序 列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3′。每個cDNA 樣本重復檢測3 次熒光定量PCR，運用2-ΔΔCt值計算Cx43 mRNA相對表達量。

1.4 統計學方法運用直接計數法統計兩組等位基因和基因型頻率；采用χ2檢驗方法統計兩組的等位基因和基因型頻率分布比較以及哈迪-溫伯格定律（Hardy-Weinburg equilibrium，HWE）檢測；采用均數±標準差來表示計量資料，兩組間的均數比較采用t檢驗；采用Logistic 回歸分析校正兩組臨床資料后進一步分析基因多態性與ACI 易感性的關系。本次研究數據統計分析運用SPSS 19.0 軟件，均為雙側檢驗，P＜0.05 代表組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料病例組HDL 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。病例組CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血壓患病率及吸煙率明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 兩組Cx43 基因rs2071166 多態性位點的等位基因和基因型頻率分布病例組和對照組的Cx43基因rs2071166 多態性位點基因型頻率分布均符合HWE（P= 0.134、0.415）。病例組Cx43 基因rs2071166 多態性位點的AA、AC 和CC 基因型頻率分別是56.7 %、35.0 %和8.3 %，對照組分別是67.7%、28.3%和4.0%，兩組比較差異有統計學意義（AAvs.ACvs.CC：P= 0.008；顯性模型CC + ACvs.AA：P=0.005；隱性模型CCvs.AC+AA：P=0.027）；病例組Cx43 基因rs2071166 多態性位點C 等位基因頻率明顯高于對照組（25.8 %vs.18.2 %，OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P=0.001，見表2）。

表2 兩組Cx43 基因rs2071166 位點基因型和等位基因頻率分布比較Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs2071166 between the case group and control group例（%）

2.3 Cx43 mRNA 相對表達量的比較和rs2071166多態性位點對Cx43 mRNA 相對表達量的影響隨機選取的病例組30 例的外周血單個核細胞Cx43 mRNA 相對表達量明顯低于對照組30 例［（0.32 ±0.07）vs.（0.67±0.12）］，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。對對照組30 例rs2071166 多態性位點的基因型與Cx43 mRNA 相對表達量的關系分析提示CC + AC 基因型（C 等位基因攜帶者）的外周血單個核細胞Cx43 mRNA 相對表達量明顯低于AA 基因型［（0.39±0.09）vs.（0.94±0.15），P＜0.05］，見圖2。

圖1 病例組和對照組外周血單個核細胞Cx43 mRNA 相對表達量比較Fig.1 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression in the mononuclear cells between the case group and control group

圖2 Cx43 基因rs2071166 位點不同基因型Cx43 mRNA 相對表達量比較Fig.2 The comparison of the Cx43 mRNA relative expression between the different genotypes of the SNP rs2071166 in the Cx43 gene

3 討論

腦動脈粥樣硬化是引起ACI 的最常見病因，其中動脈粥樣硬化具體的發病機制尚未完全明確［17-18］。近年來，大量研究表明縫隙連接與動脈粥樣硬化之間存在非常密切的關聯。縫隙連接廣泛分布于哺乳類動物的各種細胞、組織和器官（紅細胞和骨骼肌除外），與血管平滑肌細胞的增生和血管內皮細胞損傷、修復密切相關，參與動脈粥樣硬化的發病機制［19-21］。

縫隙連接蛋白目前在哺乳類動物中發現至少有20 余種，并根據各自的分子量來命名。Cx43 編碼分子量為43 kDa 的多肽，包含有387 個氨基酸。LERNER 等［22］研究表明Cx43 的異常表達和動脈粥樣硬化、缺血性心臟病密切相關。國內學者劉坤等［23］研究發現大鼠大腦中星形膠質細胞Cx43 的表達參與急性腦缺血的病理過程。人Cx43 基因位于6 號染色體長臂2 區，主要由1 個內含子和2 個外顯子組成。近年來，WANG 等［24］研究發現Cx43 基因多態性與漢族人群高血壓病相關。洪濤等［25］報道了Cx43 基因S368 位點與腦血管痙攣有關。

本研究發現ACI 患者HDL 低于對照組，CHOL、TG、LDL、空腹血糖、2 型糖尿病患病率、高血壓患病率及吸煙率明顯高于對照組，差異均有統計學意義，這提示血脂異常、糖尿病、高血壓病及吸煙與ACI 的發病密切相關。ACI 患者rs2071166 位點的基因型頻率分布與對照組相比，差異有統計學意義，其中ACI 患者CC+AC 基因型（C 等位基因攜帶者）明顯高于對照組（OR=1.600，95%CI：1.147 ～2.232，P=0.005）。Logistic 回歸分析校正年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、2 型糖尿病史、空腹血糖、CHOL、TG、HDL 和LDL等多個混雜因素后，結果依然顯示rs2071166 位點顯性模型和隱性模型均與ACI 發病風險有關（P= 0.017、0.041）。此外，ACI 患者C 等位基因明顯高于對照組（OR=1.569，95%CI：1.190 ～2.069，P= 0.001）。這提示rs2071166 位點C 等位基因可能是ACI 易感性的危險因素。同時，本研究發現ACI 患者Cx43 mRNA 相對表達量明顯低于對照組（P＜0.05），并且對照組C 等位基因攜帶者的Cx43 mRNA 相對表達量明顯低于AA 基因型（P＜0.05）?；诖耍疚耐茰yrs2071166 多態性位點的C 等位基因可能降低Cx43 基因的啟動子活性，從而導致Cx43 mRNA 的表達下調。GU 等［15］通過斑馬魚研究發現攜帶rs2071166 位點CC 基因型的個體其Cx43 基因啟動子活性明顯低于AA + AC 基因型，這與我們的推測相一致。

本研究從分子遺傳學角度研究Cx43 基因多態性與ACI 易感性的關系，并發現rs2071166 位點C 等位基因可能是ACI 易感性的危險因素。但是，本次研究仍存在以下幾點不足。首先，本研究病例-對照研究的樣本量相對少。其次，本研究只分析了Cx43 基因啟動子區rs2071166 位點與ACI 易感性的相關性?；诖?，后續會加大樣本量，并選取Cx43 基因其余多態位點進一步分析其與ACI 的關系。此外，針對不同時期、不同TOAST 分型的缺血性腦梗死分析其與Cx43 基因表達的相關性，會作并進一步對啟動子區多態性位點進行功能相關性研究。

綜上所述，Cx43 基因啟動子區rs2071166 多態性位點與ACI 易感性密切相關，其中C 等位基因可能通過降低啟動子轉錄活性導致Cx43 基因表達下調，進而參與ACI 的發病。