TLR4Asp299Gly、Thr399Ile基因多態性與梅毒的相關性

羅麗 張鑫 胡潔 張信江

1遵義醫科大學附屬醫院皮膚科（貴州遵義563003）；2平頂山市第二人民醫院皮膚科（河南平頂山467000）

梅毒是梅毒螺旋體感染引起的性傳播疾病，主要通過性接觸傳播，隨著改革開放及社會經濟的發展，梅毒患者也不斷增多，嚴重威脅人類的身心健康［1-2］。目前梅毒的發病機制尚未完全闡明，大量研究表明，人在感染梅毒螺旋體后，體內發生一系列復雜的體液和細胞免疫過程，導致患者血管通透性增加，感染部位聚集多種炎癥細胞，對早期梅毒螺旋體的清除有利［3-5］。Toll 樣受體TLRs（Toll like receptors，TLRs）是近年來發現的新型細胞受體家族，它通過識別病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）介導跨膜信號傳遞，能夠激活多種炎癥因子的表達［6-8］。目前對梅毒與TLRs 受體家族的相關研究的報道相對較少。有研究顯示，TLR2 在梅毒感染機體免疫識別信號轉導過程中起著一定的作用［9-10］。目前研究較多的是TLR2 兩個SNP 位點Arg677Trp 和Arg753Gln 多態性與感染性疾病的關系，有研究表明TLR2 Arg677Trp 多態性在牙周炎患者中呈高檢出率［11］。國內僅發現有學者對梅毒患者與Toll 樣受體2 基因單核苷酸多態性研究［12］，但是目前并未發現有關于梅毒與TLR4 基因多態性的相關性研究報道。

作為TLRS 家族中要的成員，目前發現TLR4基因在編碼區至少存在+896A/G 與+1196C/T 兩個特征性單核苷酸多態性位點，即Asp299Gly 和Thr399Ile，但是尚未見關于TLR4 基因多態性與梅毒相關性的報道［13］。本研究旨在探討TLR4 的基因Asp299Gly 和Thr399Ile 的多態性與梅毒的關系，以期為闡明梅毒易感性和先天性免疫機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料在知情同意和倫理道德原則下，選擇2012～2014年在本院皮膚性病門診及其他科住院篩查確診的梅毒患者120 例為實驗組，經TPPA、TRUST 試驗檢測均陽性，TRUST 滴度1∶1 ～160；未合并其他性傳播疾病。包括顯性梅毒53 例（一期24 例，二期29 例），隱性梅毒67 例（TPPA 和TRUST 試驗檢測均陽性，無任何癥狀和體征，并隨訪3 個月以上）。實驗組再分為兩組，一組（60 例）為性伴侶或夫妻雙方中有1 人發病者，年齡20 ～60 歲，平均39.2 歲，另一組（60 例）為性伴侶或夫妻雙方共同發病者，年齡23 ～62 歲，平均37.4 歲。選擇近期無細菌、真菌、病毒等各種感染的健康人60 例為對照組，年齡18 ～45 歲，平均34.3 歲。梅毒診斷須根據病史、臨床癥狀、體檢及實驗室檢查等綜合分析。一期梅毒臨床表現為硬下疳和腹股溝或患部近位淋巴結腫大。二期梅毒表現為多形性皮疹，常泛發對稱，自覺癥狀輕微。三期梅毒常見結節性皮疹及皮膚、黏膜、骨骼樹膠腫等。

1.2 外周血基因組的提取無菌操作下對研究對象各抽取外周血5 mL，EDTA 抗凝，室溫下3 000 r/min離心10 min 提取白細胞層。使用Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒提取mtDNA，具體操作步驟依據試劑盒說明書。

1.3 Asp299Gly和Thr399Ile的PCR擴增和產物電泳鑒定引物由上海生工程公司設計合成，采用上海生物工撐公司PCR 擴增試劑盒按，配制成25 μL PCR 反應體系，PCR 后對產物進行電泳鑒定。Asp299Gly 引物序列為：上游：5′-GATTAGCATACT TAGACTACTACCTCCATG-3′；下游：5′-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3′。Thr399Ile 引物序列為：上游：5′-GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTT GGGAGAA-3′；下游：5′-CCTGAAGACTGGAGAGTG AGTTAAATGCT-3′。

1.4 測序及結果分析將PCR 產物寄往上海生物工程公司進行純化、測序及拼接。將拼接序列與NCBI 中TLR4 的全基因序列進行比對，查看變異堿基位置并統計記錄，根據統計結果比較實驗組與對照組，觀察所測位點是否存在高突變堿基位點。

1.5 統計學方法將實驗組和正常對照組的測序結果與劍橋序列進行比對后，統計兩組中突變的位點及突變頻率后作χ2檢驗，采用SPSS 19.0 進行統計學分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組及對照組Asp299Gly和Thr399Ile PCR產物的電泳結果結果顯示，分子量標準物條帶最亮為500 bp，DNA 濃度約為150 ng，Asp299Gly 片段PCR 產物大小為249 bp，Thr399Ile 片段PCR 產物大小為406 bp，符合測序要求。圖1A、圖1B 分別為Asp299Gly 片段和Thr399Ile 片段PCR 產物一人患病組和夫妻同患組各隨機抽取5 個樣本電泳圖，M 為DNA Marker（DL 1 000 bp），條帶1、2、3、4、5 為一人患病組樣本，6、7、8、9、10 為夫妻同患組樣本。圖1C 為隨機抽取的3 個對照組樣本電泳圖，條帶1、2、3 為Asp299Gly PCR 產物，條帶4、5、6為Thr399Ile PCR 產物。

圖1 PCR 產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products

2.2 Asp299Gly、Thr399Ile SNP 位點及突變頻率統計研究發現，梅毒患者TLR4 基因Asp299Gly片段中（即核苷酸位點2296-2544區域內）共有19個位點存在多態性，但未發現Asp299Gly 特征性突變位點A/G 及Thr399Ile 特征性突變位點C/T。由于實驗組中一人發病組與兩人均發病組的高突變位點大致相同，無特殊差異性，所以綜合統計其重要突變位點及突變頻率如下：位點2463 上A 缺失，發生頻率為13.8%（11/80）；位點2498 上A 缺失，發生頻率為30%（24/80）；位點2503 上A 缺失，突變頻率為10%（8/80）；位點2533 上C 突變為A，發生頻率為13.8%（11/80）；位點2533 上C 缺失，發生頻率為13.8%（11/80）；位點2535 上G 缺失，發生頻率為15%（12/80）。梅毒患者TLR4 基因Thr399Ile 片段中（即核苷酸位點2595-3000 區域內）共有22 個位點存在多態性，多為單個堿基突變，高突變位點較少。一人發病組重要突變位點及突變頻率如下：位點2990上C突變為A，突變頻率為10%（4/40）；位點2992 上G 突變為C，發生頻率為10%（4/40）。兩人均發病組重要突變位點及突變頻率如下（見表2.2.4）：位點2631上C突變為A，發生頻率為7.5%（3/40）；位點2633上A缺失，發生頻率為10%（4/40）；位點2989 上C 缺失，發生頻率為7.5%（3/40）；位點2992上G突變為C，突變頻率為7.5%（3/40）。

2.3 Asp299Gly、Thr399Ile 的SNP 位點突變頻率在各組中分布情況的統計結果將Asp299Gly、Thr399Ile 突變頻率較高位點進行組間兩兩比較，結果顯示：一人患病組Asp299Gly高突變位點2498A缺、2535G 缺失差異有統計學意義（P＜0.05）（表1），兩人均發病組Asp299Gly 高突變位點2463A 缺失、2498A 缺失差異有統計學意義（P＜0.05）（表2），而實驗組中一人患病組與兩人均發病組對比，所有高突變位點頻率分布差異均無統計學意義（P＞0.05），故實驗組中一人患病組與兩人均發病組無特殊差異，對兩組中差異有統計學意義位點進行綜合統計結果見表3，將結果進行χ2檢驗，結果顯示位點2498A 缺失差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前梅毒免疫發病機制尚不明確，研究認為，人體感染梅毒螺旋體后，體內將發生一系列復雜的細胞免疫和體液免疫，而這些免疫反應的類型、強度和持續時間將影響疾病的嚴重程度、病程及轉歸，這提示梅毒的遺傳易感性可能與某些免疫相關基因存在關聯［14-16］。Toll 樣受體作為天然免疫中的重要識別受體，在感染性疾病的防御中將會有不可替代的作用，其多態性可能影響疾病的發病，病情以及預后［17-19］。

表1 一人患病組和對照組Asp299Gly 高突變位點分布頻率Tab.1 Distribution frequencies of Asp299Gly high mutation sites in one patient and control group

表2 兩人均患病組和對照組Asp299Gly 高突變位點分布頻率結果Tabl.2 Distribution Frequency of Asp299Gly High Mutation Sites in Patients and Control Groups

表3 病例組綜合統計結果Tab.3 Comprehensive statistical results of case group

鑒于人類TLR 基因在機體天然免疫中的重要的功能，其基因變異也倍受關注［20-21］。目前對梅毒與TLRs 受體家族的相關研究的報道相對較少，國內僅發現有學者對梅毒患者與Toll 樣受體2 基因單核苷酸多態性研究［18］，并未發現有關于梅毒與TLR4 基因多態性的相關性研究報道。作為TLRs 家族中要的成員，目前發現TLR4 基因在編碼區至少存在+896A/G 與+1196C/T 兩個特征性單核苷酸多態性位點，即Asp299Gly 和Thr399Ile。研究表明［22-23］，TLR4 作為LPS 的識別受體，其基因第4 外顯子Asp299Gly 的突變，可改變TLR4 的細胞外結構，導致對LPS 無反應或LPS 信號通路抑制。因此，本研究探討TLR4Asp299Gly/Thr399Ile 的多態性與梅毒的關系。

本研究發現，在對照組和實驗組中均未檢測到Asp299Gly 特征性突變位點A/G 及Thr399Ile 特征性突變位點C/T。梅毒患者TLR4的基因Asp299Gly片段和Thr399Ile 片段突變率增加，Asp299Gly 片段（即核苷酸位點2296-2544 區域內）中共有19 個位點存在多態性，Thr399Ile 片段中（即核苷酸位點2595-3000 區域內）共有22 個位點存在多態性。本研究中Asp299Gly 片段2498 位點突變率較高，差異具有統計學意義（P＜0.05），但目前沒有報告表明此位點是梅毒患者TLR4 基因的特征性多態性位點。不足之處是本次試驗患者樣本量較少，因此有一定局限性。下一步研究方向可以通過增加樣本含量進一步做此方面的研究，以期為闡明梅毒易感性和先天性免疫機制提供依據，這對從基因多態性層面，再結合其他方面的數據尋找預防、診斷、治療梅毒的方法有重要意義。