LncRNA SNHG11在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及臨床意義

陶紹能 王瑩瑩 楊軍 程光華 戴云海 呂坤

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院1核醫(yī)學(xué)科，2中心實(shí)驗(yàn)室（安徽蕪湖241000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見 的癌癥之一，其病死率居世界男性和女性惡性腫瘤的第三位［1］。報(bào)告表明，CRC 患者的5年相對生存率從90%以上（早期患者）到略＞10%（第四階段患者）不等［2］。因此，篩選早期CRC 生物標(biāo)志物對于預(yù)防和正確管理疾病進(jìn)展和控制CRC 誘導(dǎo)的病死率至關(guān)重要［3］。近年來，無創(chuàng)生物標(biāo)志物的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)。然而，常用的血清腫瘤生物標(biāo)志物CEA 和CA19-9，對早期CRC 診斷具有有限的敏感性和特異性，并產(chǎn)生有爭議的預(yù)后價(jià)值［4-5］。因此迫切需要具有高靈敏度和特異性的新型無創(chuàng)分子診斷生物標(biāo)志物。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）包含長度超過200 nt RNA，蛋白質(zhì)編碼能力有限或者無蛋白質(zhì)編碼能力的一類轉(zhuǎn)錄物。循環(huán)中的LncRNAs 已被證實(shí)在結(jié)直腸癌中具有診斷價(jià)值［6-8］，這表明LncRNA 作為腫瘤生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。SNHG11（small nucleolar RNA host gene 11）位于人類染色體20q11.23，長4 268 bp，屬于LncRNA［9］。現(xiàn)有對LncRNA 研究的文獻(xiàn)資料大部分是對患者組織樣本的，對外周血中LncRNA的研究甚少。本研究擬通過檢測結(jié)直腸癌患者血清中SNHG11 的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析其與臨床病理資料之間的關(guān)系，從而探索SNHG11 作為結(jié)直腸癌的一種生物標(biāo)記物的可能性及其臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料我院住院的結(jié)直腸癌患者（CRC組）70 例，平均年齡（62.2±11.6）歲。其中男51 例，平均年齡（63.6 ± 11.1）歲；女19 例，平均年齡（58.4± 12.3）歲。結(jié)直腸良性疾病（CBD 組）35 例，平均年齡（55.7 ± 11.2）歲。其中男23 例，平均年齡（54.0±10.6）歲；女12 例，平均年齡（56.4±9.7）歲。所有病例均有病理診斷，其術(shù)前未接受任何放化療治療。同時(shí)選取接受體檢的健康人（NC 組）35 例作為對照組，平均年齡（59.9±12.6）歲。其中男23 例，平均年齡（63.9 ± 11.8）歲；女12 例，平均年齡（52.4±10.8）歲。

1.2 主要儀器及試劑Trizol 試劑（北京天根生化科技有限公司）；RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA 熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；LncRNA SNHG11 與內(nèi)參基因β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器包括臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（美國Thermo 公司），RNA 濃度檢測儀（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 樣本收集清晨空腹抽取靜脈血5 mL，4 h 內(nèi)在4 ℃，16 000 ×g，離心10 min 取上清液至無RNA酶的EP 管中；為更加徹底去除血清中雜質(zhì)成分對試驗(yàn)結(jié)果的影響，4 ℃，1 600×g再離心10 min。將分離的血清置于無RNA 酶的EP 管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA 提取將分離的血清置于冰上融化解凍后，嚴(yán)格按照試劑說明書提取總RNA。將提取的總RNA 用分光光度儀測定其濃度和純度。選取A260/A280在1.8～2.0 的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序：25 ℃10 min，42 ℃45 min，70 ℃15 min。cDNA樣本置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qRT-PCR 檢測LncRNASNHG11 的表達(dá)以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，采用qRT-PCR 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。SNHG11 引物序列：上游5′-GTGTGAGGATGTCCCTGGAT-3′，下游5′-CCCCAAACAATCATGAGGAG-3′；內(nèi)參β-actin 引物序列：上游5′-AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA-3′，下游：5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。預(yù)變性95 ℃10 min；PCR反應(yīng)以95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃10 s 為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)：溶解曲線分析95 ℃30 s、70 ℃1 s、95 ℃1 s。采用ΔCt 法計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)值，作為評估目的基因在疾病組和健康對照組中表達(dá)差異的指標(biāo)。ΔCt=CtSNHG11-Ctβ-actin，ROC 曲線采用2-ΔΔCt。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組之間比較采用Mann-WhineyU檢驗(yàn)，三組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清LncRNA SNHG11 在良惡性結(jié)直腸疾病中的表達(dá)與健康對照組比較，SNHG11 在結(jié)直腸癌中明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.583，P＜0.01），而與結(jié)直腸良性疾病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.100，P= 0.272）。結(jié)直腸良惡性疾病差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.613，P＜0.01），見圖1A。SNHG11 在TNMⅠ/Ⅱ期中的表達(dá)較健康對照組明顯升高（Z=-4.667，P＜0.01），但是在TNMⅠ/Ⅱ期與TNM Ⅲ/Ⅳ期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.233，P=0.218），見圖1B。

2.2 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、TNM 分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

2.3 血清SNHG11 對結(jié)直腸癌診斷價(jià)值的分析見圖2。血清SNHG11 診斷結(jié)直腸癌的AUC 優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199（0.866、0.714、0.638），診斷敏感性明顯高于CEA 和CA199，分別為0.786、0.457、0.343，但是特異性略低于CEA、CA199，分別為0.871、0.929、0.929。聯(lián)合CEA 檢測可略提高檢測效能（AUC = 0.895），提高檢測的靈敏度。見表2。

圖1 SNHG11 在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)Fig.1 Expressionlevelof SNHG 11 in serum of patients with colorectal cancer

圖2 血清SNHG11 與CEA、CA199 診斷結(jié)直腸癌ROC 曲線圖Fig.2 ROC curve of serum SNHG11，CEA and CA199 in the diagnosis of colorectal cancer

表1 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

表1 結(jié)直腸癌患者血清SNHG11 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between serum SNHG11 level and clinicopathological parameters in patients with colorectal cancer ±s

病理參數(shù)年齡≥60 歲＜60 歲性別男 女TNM 分期Ⅰ/Ⅱ期Ⅲ/Ⅳ期病理類型潰瘍型隆起型浸潤型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有 無例數(shù)40 30 51 19 32 38 54 13 3 33 37 11 59 SNHG11（ΔCt）3.623±0.956 3.860±1.251 3.647±1.053 3.932±1.189 3.484±1.089 3.926±1.063 3.602±1.091 4.192±1.103 3.900±0.557 3.997±1.109 3.481±1.027 3.756±1.162 3.555±0.570 Z/H 值-0.570-0.767-1.233 2.439-1.619-0.525 P 值0.569 0.443 0.218 0.295 0.105 0.600

表2 SNHG11 在結(jié)直腸癌中的診斷效能分析Tab.2 Analysis of diagnostic efficacy ofSNHG11 in colorectal cancer

3 討論

LncRNA 是一種調(diào)節(jié)性RNA，在眾多細(xì)胞途徑中起著關(guān)鍵作用。全基因組分析發(fā)現(xiàn)許多LncRNA在惡性組織和正常組織之間有差異表達(dá)［10-11］，武雪亮等［12］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR mRNA 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯較正常結(jié)直腸組織高，與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系密切。此外，腫瘤衍生的LncRNA 可以在多種生物體液中檢測并保持穩(wěn)定［10，13］，這些表明LncRNA 有可能作為癌癥診斷和預(yù)后的無創(chuàng)生物標(biāo)記物。

SNHGs 在各種腫瘤中得到了廣泛的研究，例如，SNHG 6 通過miR-101-3p 和Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展［14］。SNHG8 通過對miR-149-5p 的應(yīng)答促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)［15］。SNHG1 通過miR-448/IDO 調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞分化，影響乳腺癌的免疫逃逸［16］。SNHG2 被稱為GAS5，是一種腫瘤抑制基因，GAS5 的下調(diào)與CRC 的惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［17］。SNHG14 在乳腺癌中高表達(dá)并通過miR-144/CEP55信號軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移［18］。SNHG11位于人類染色體20q11.23，屬于LncRNA。但是SNHG11 在結(jié)直腸疾病中的報(bào)道較為罕見。本研究結(jié)果顯示，血清SNHG11 不但在CRC 患者與健康對照相比明顯升高，而且與結(jié)直腸良性疾病相比也升高，這在臨床上將有利于根據(jù)SNHG11 血清水平來判斷結(jié)直腸疾病的嚴(yán)重程度，從而采取相應(yīng)的治療措施改善結(jié)直腸疾病患者的預(yù)后。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)CRC 患者在TNM Ⅰ/Ⅱ期時(shí)其SNHG11 血清水平較健康對照升高，說明其在早期診斷方面可能具有一定的價(jià)值。但是，其在CRC患者中的表達(dá)水平并不隨腫瘤的發(fā)展而升高，其具體機(jī)制不明，有待于進(jìn)一步的研究。

有文獻(xiàn)報(bào)道［19］SNHG11 在組織中的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。最近，XU 等［20］報(bào)道血漿SNHG11 在CRC 中可作為早期診斷和預(yù)后的一個(gè)新的生物標(biāo)志物。但是在本研究中血清SNHG11 與臨床相關(guān)病理參數(shù)之間并無相關(guān)性，這可能與患者標(biāo)本來源不同、腫瘤異質(zhì)性、研究病例的多少等多種因素有關(guān)。

通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清SNHG11 在結(jié)直腸癌中的診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199（AUC = 0.866、0.714、0.638），其靈敏度可達(dá)78.6%，特異性可達(dá)87.1%，聯(lián)合CEA 可提高其診斷效能（AUC = 0.895），聯(lián)合CA199 對診斷效能提高不顯著。但是本研究未能觀察治療前后血清SNHG11 在血清中的變化，無法判斷其是否可作為治療監(jiān)測指標(biāo)，后續(xù)將擴(kuò)大病例進(jìn)一步研究其在早期診斷及治療監(jiān)測方面的作用。

總之，SNHG11 在結(jié)直腸癌患者血清中異常高表達(dá)，可作為結(jié)直腸癌新的診斷循環(huán)分子標(biāo)志物，與CEA 聯(lián)合診斷可提高結(jié)直腸癌的診斷效能。