陜西省健康人群腦膜炎奈瑟菌帶菌率調(diào)查及其血清群分布特征

胡偉軍 王銳澤 王月祺 張少白

陜西省疾病預(yù)防控制中心（西安710054）

腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）簡稱為腦膜炎球菌（meningococcus），是流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）的病原菌。流腦屬于急性呼吸道傳染病，常在冬春季節(jié)發(fā)病，早期極易被誤診，即使得到及時(shí)診斷并治療，仍有8%～15%的病死率，20%的幸存者會出現(xiàn)嚴(yán)重的后遺癥，且嬰兒、兒童和青少年高發(fā)，疾病危害嚴(yán)重。Nm 根據(jù)其莢膜多糖抗原群特異性，可分為13 個(gè)血清群（A、B、C、D、E、H、I、K、L、W、X、Y、Z），其中6 個(gè)血清群（A、B、C、W、X、Y）在全球細(xì)菌性腦膜炎疾病中最為流行［1-5］。

中國在1938-1977年間經(jīng)歷了5 次流腦流行，其中1967年發(fā)病率最高（403/10 萬），病死率約為5.5%［6］。20 世紀(jì)80年代中國大規(guī)模的接種A 群多糖流腦疫苗及2008年政府將A+C 群多糖流腦疫苗納入免疫規(guī)劃后，中國的病例報(bào)告數(shù)顯著下降，但仍存在局部暴發(fā)流行。Nm 在亞洲主要流行株為A 群和C 群，偶有B、W 和Y 群流行。在中國，Nm 流行株近10年發(fā)生較大變化，A 群病例比例明顯下降，C 群先升高后降低，B、W 群及未分群病例上升趨勢明顯［7-8］。

研究顯示流腦健康人群帶菌情況與疾病的發(fā)病具有明顯的關(guān)聯(lián)性。目前，陜西省健康人群腦膜炎奈瑟菌攜帶情況及其菌群分布的基礎(chǔ)資料較少。為了解陜西省健康人群腦膜炎奈瑟菌攜帶狀況，及時(shí)采取有效防治措施，本研究于2016年10月至2017年7月選取4 個(gè)地市開展了健康人群Nm 帶菌率調(diào)查，現(xiàn)將調(diào)查結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 抽樣對象和抽樣方法本研究根據(jù)陜西省地域和氣候特征，在陜北地區(qū)選擇延安市，關(guān)中地區(qū)選擇西安市和寶雞市（關(guān)中地域狹長且人口較多），陜南地區(qū)選擇安康市開展調(diào)查，其中西安市和寶雞市各隨機(jī)選取兩個(gè)縣，延安市和安康市各選取一個(gè)縣開展調(diào)查。調(diào)查區(qū)縣隨機(jī)抽取兩個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，人群按年齡分層采取整群隨機(jī)抽樣，分0 ～2、3 ～5、6 ～14、15 ～24、25 ～44 及≥45 歲6 個(gè)年齡段采集血清標(biāo)本，調(diào)查對象在接受調(diào)查時(shí)均為健康個(gè)體。文獻(xiàn)報(bào)道我國部分地區(qū)Nm 帶菌率約為30%，p 以此預(yù)估，取容許誤差d = 0.1 p，設(shè)計(jì)效應(yīng)系數(shù)deff = 1.25，估算樣本量n= 1 120 例。樣本量計(jì)算公式= 1 120（人）。每個(gè)地市每個(gè)年齡段采樣對象不少于40 例，總?cè)藬?shù)不少于240 例，男女比例均衡。

1.2 主要試劑和儀器標(biāo)本采集使用COPAN 公司的咽拭子，細(xì)菌培養(yǎng)采用巧克力雙抗培養(yǎng)基和哥倫比亞血平板，核酸提取使用廣州美基公司試劑盒，生化分析采用梅里埃公司全自動生化分析儀，核酸鑒定使用Bio-Rad7500 Real-time PCR 儀，所用引物均由國家疾控中心提供。

1.3 菌株鑒定在征得調(diào)查對象同意基礎(chǔ)上采集調(diào)查對象咽拭子，同時(shí)進(jìn)行疫苗接種史等流行病學(xué)調(diào)查，采集的標(biāo)本現(xiàn)場接種至巧克力雙抗培養(yǎng)基，并在當(dāng)?shù)丶部刂行倪M(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)出的菌落轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平板進(jìn)一步通過生化鑒定和血清撥片凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.4 核酸提取和PCR 鑒定將采集到接種對象的咽拭子標(biāo)本洗脫后提取核酸，根據(jù)ctrA 基因鑒定Nm 種屬，陽性標(biāo)本進(jìn)行A、B、C、X、Y、W 常見血清群的real-time PCR 檢測［9-10］。見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法監(jiān)測數(shù)據(jù)通過Excel 軟件進(jìn)行錄入和整理，采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。不同地區(qū)、年齡、性別人群帶菌情況比較采用χ2檢驗(yàn)，不同年齡人群帶菌情況比較采用秩和檢驗(yàn)，不同人群帶菌情況影響因素采用多分類Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢出率對1 539 例調(diào)查對象咽拭子進(jìn)行Nm 培養(yǎng)，陽性標(biāo)本46 例（2.99%）。延安、西安、寶雞和安康市陽性率分別為2.30%、2.45%、3.14%、4.29%。經(jīng)玻片血清凝集反應(yīng)鑒定，在46份陽性菌株中，A 群1 株，占2.17%；B 群11 株，占23.91%；C 群5 株，占10.87%；不可分群29 株，占63.04%。見表2。

2.2 核酸鑒定帶菌率采用Real-time PCR 對咽拭子洗脫液進(jìn)行核酸檢測，結(jié)果顯示1 539 例健康人群中Nm 核酸陽性110 例，陽性率為7.15%。陽性標(biāo)本中A 群1 株（0.91%），B 群19 株（17.27%），C群16 株（14.55%），不可分群74 株（67.27%）。四市健康人群Nm 核酸陽性率安康市最高（10.71%），其次分別為延安市（6.13%）、西安市（8.25%）和寶雞市（4.50%），分地區(qū)分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 11.88，P＜0.01）。四城市Nm 核酸菌群分年齡構(gòu)成中15 ～24 歲組最高（16.36%），0 ～2 歲組最低（4.03%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 1 200.08，P＜0.01）。見表3。

經(jīng)多分類Logistic 回歸分析，影響Nm 帶菌情況的的危險(xiǎn)因素有年齡（15 ～24 歲）、性別和所在地區(qū)（安康市和延安市）。其中，A 群危險(xiǎn)因素包括年齡（＞15 歲，P＜0.05）、女性和西安地區(qū)（P＜0.05）。B 群、C 群危險(xiǎn)因素主要為安康地區(qū)和延安地區(qū)。未分組菌型的危險(xiǎn)因素為15～24 歲年齡和寶雞以及安康地區(qū)。見表4。

表1 腦膜炎奈瑟菌血清型分群Real-time PCR 引物Tab.1 Serotype grouping real time PCR primers of Neisseria meningitidis

表2 陜西省不同地區(qū)健康人群腦膜炎奈瑟菌帶菌情況Tab.2 Neisseria meningitidis infection in healthy population from different areas of Shaanxi province

3 討論

陜西省自1950年進(jìn)行流腦疫情的傳染病報(bào)告以來，曾于1957、1967、1977、1985年發(fā)生過4 次流腦大流行，1992年以后發(fā)病率一直保持在1/10 萬以下，再無暴發(fā)疫情。2004年陜西省將流腦A 群疫苗接種納入計(jì)劃免疫，對適齡兒童實(shí)施免費(fèi)接種，通過小年齡組持續(xù)高覆蓋的疫苗接種，流腦疾病流行得到明顯控制，但同時(shí)Nm 主要致病菌株和健康人群攜帶Nm 血清型也發(fā)生了很大變化，為更好地了解陜西省健康人群Nm 帶菌狀況，本研究選取4 個(gè)地市開展健康人群Nm 帶菌狀況調(diào)查，調(diào)查結(jié)果Nm培養(yǎng)陽性率2.99%，高于河北省調(diào)查帶菌率1.03%［11］，低于江蘇省2015年帶菌率10.07%［12］，整體處于較低水平。Real-time PCR 核酸檢測結(jié)果Nm 陽性率為7.15%，其中細(xì)菌培養(yǎng)陽性者核酸檢測均為陽性，Real-time PCR 相較于細(xì)菌培養(yǎng)敏感度更高，且可降低抗菌素使用的干擾［13-14］，具有更高的檢出率。

本次調(diào)查的110 例Nm 核酸陽性者中，不可分群血清型最多（67.27%），其次為B 群（17.27%）和C群（14.55%）。歷史上，中國以A 群Nm 引起的流腦為主［15］，B 群、C 群只引起散發(fā)病例。但隨著A 群流腦多糖疫苗和A+C 群流腦多糖疫苗納入兒童計(jì)劃免疫后高覆蓋率使用，Nm 流行的優(yōu)勢血清群正在發(fā)生變遷，我國2006-2014年流腦實(shí)驗(yàn)室確診病例監(jiān)測顯示以C 群（44.81%）最多，其次為A 群（26.08%）和B 群（15.19%）。2015-2017年監(jiān)測結(jié)果則以B 群（35.81%）為主，其次為C 群（18.24%）和A 群（6.76%），與我省監(jiān)測結(jié)果基本一致。研究顯示B 群Nm 引起的流腦病例比例正在顯著增加，近年來已經(jīng)成為病例最多的血清型［16-18］。本次調(diào)

查陽性菌株不可分群最多，傳統(tǒng)研究認(rèn)為不可分型Nm 多為健康人群攜帶，較少致病［19］，但國內(nèi)已有不可分群菌株感染引起的腦膜炎病例的報(bào)道［20］，提示不可分群Nm 監(jiān)測同樣不可忽視。

表3 基于PCR 核酸檢測陜西省健康人群Nm 帶菌情況Tab.3 Detection of Neisseria meningitidis carrier in healthy population of Shaanxi province based on PCR

表4 陜西省健康人群Nm 帶菌情況多分類Logistic 回歸影響因素分析Tab.4 Analysis of influencing factors of multi classification logistic regression for Neisseria meningitidis carrier in healthy population of Shaanxi province

本次監(jiān)測分地區(qū)Nm 帶菌率安康市最高，其次為延安市，可能與當(dāng)?shù)貧夂驐l件及疫苗接種情況有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探究，提示應(yīng)更加關(guān)注兩地流腦防控工作。分年齡組Nm 帶菌率先升高后降低再升高，分析原因，0 ～5 歲組兒童活動范圍局限且接種疫苗時(shí)間不長，帶菌率最低，6 ～14 歲因疫苗抗體水平逐漸下降并開始學(xué)校集體生活，帶菌率出現(xiàn)升高趨勢，15 ～24 歲組帶菌率最高，25 ～44 歲組帶菌率較低考慮與我國流腦大流行人群自然感染有關(guān)，≥45 歲組帶菌率升高可能與該年齡段人群免疫力下降有關(guān)［21］。陜西省Nm 帶菌年齡分布特征與河北省調(diào)查結(jié)果基本一致［12］。

健康人群Nm 帶菌情況與流腦發(fā)病趨勢相關(guān)明顯，長期監(jiān)測健康人群Nm 帶菌率對于預(yù)測我省流腦發(fā)病及菌群變遷的提示作用意義重大，建議持續(xù)擴(kuò)大范圍開展各地區(qū)健康人群Nm 帶菌率，以便根據(jù)Nm 分布特征及菌群變遷趨勢及時(shí)調(diào)整流腦防控措施。