梨果實細胞分裂期內參基因表達穩定性分析

蒲小秋，田 嘉，李 疆，張 艷，李 鵬，覃偉銘，井春芝

（1.新疆農業大學 林學與園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區巴音郭楞蒙古自治州沙依東園藝場，新疆 庫爾勒 841000；3.新疆維吾爾自治區巴音郭楞蒙古自治州林業科學技術推廣中心，新疆 庫爾勒 841000）

實時熒光定量PCR技術（quantitative real-time PCR technology，qRT-PCR technology）是開展基因表達分析的關鍵技術，以循環放大材料中本底基因表達量與熒光檢測相結合的方法定量分析基因表達量，具有高效、靈敏、穩定和成本低等特點[1]。qRT-PCR技術分為絕對定量和相對定量分析兩種，相對定量分析比絕對定量分析的應用更加簡單和普遍，其通過檢測樣品中目標序列和另一參照序列的表達量，通過對比兩種表達量對目標基因進行定量分析。相對定量分析結果的準確性常受RNA樣品質量、逆轉錄效率、PCR效率差異、上樣量及上樣過程等因素的干擾，因此，需選擇較為穩定的管家基因作為內參基因進行誤差校正及標準化處理，理想的內參基因在植物的不同組織中和不同發育時期及不同處理中都應能穩定表達，不存在假基因且其表達量與目的基因表達量相近[2-3]。目前，植物中常用的內參基因有甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因（GAPDH）、肌動蛋白基因（Actin）、微管蛋白基因（TUB）、轉錄延伸因子基因（EF1α）和泛素連接酶基因（UBQ）等[4]。近年來的研究結果表明，任何一個內參基因都不能適用于所有條件下的實驗研究。如GAPDH在核桃不同基因型、不同組織中、不同發育時期的表達均穩定，但在蘋果不同基因型中表達的穩定性差[5-6]；UBQ在鹽脅迫下玉蘭不同組織器官中的表達穩定，但在黃梁木不同組織中表達的穩定性差[7-8]。因此，在利用qRT-PCR進行定量分析之前，有必要驗證、篩選出穩定的內參基因，以減小供試樣本間的差異性，以期獲得更加準確、可靠的實驗結果。

梨屬于薔薇科Rosaceae梨亞科Poaceae梨屬Pyrus L.植物，在我國的分布廣泛，其種質資源豐富。梨果實可鮮食、制干、榨汁、釀酒、入藥等，具有重要的經濟價值和社會價值。梨果實的生長時期可分為細胞分裂期和細胞膨大期兩個主要時期，其在生長開始，以細胞分裂為主，在授粉50 d左右時以細胞膨大為主，梨為假果，果肉部分由花托發育形成，花期花托細胞分裂和幼果期果肉細胞分裂共同組成了梨果實細胞分裂期[9-10]。果實的細胞分裂期是對果實品質具有重要影響的時期。前人研究發現，某些基因在果實細胞分裂期大量表達，因此，果實細胞分裂期是果實品質調控的關鍵時期。如TIAN等人[11]發現，在梨幼果期，FWL1基因表達與果實大小呈反比關系，說明這一基因與梨果實大小發育密切相關；岳海林[12]研究發現，黃花梨中鈣調素（CuCaM）在盛花期子房幼果中的大量表達，可能與果實中鈣的增加有一定的關系。因此，篩選出梨果實細胞分裂期內合適的內參基因，不僅可以保證實驗的準確性，還能省時省力。目前，未見到有關梨果實細胞分裂期內參基因的篩選報道，已報道的梨中常用的內參基因分別有Actin1[13]、Actin2[14]、TUB1[15]和TUB2[16]等。本研究在對梨果實細胞分裂期的內參基因進行熒光定量PCR篩選 時，選用了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH這8個候選基因，這些基因均為傳統的內參基因，是生物體生命活動中不可或缺的。EF1α主要參與快速增殖細胞的生長與增殖[17]，UBI參與細胞中的代謝過程[4]，Actin對細胞分裂、細胞基本骨架結構的維持及細胞運動都可起到重要作用[18]，TUB控制表達生物體維持生命活動所必需的細胞器骨架的基本組分蛋白基因[19]，GAPDH與細胞骨架結構的形成有關[20]。目前，研究內參基因的常用手段分別有轉錄組分 析[21]、同源基因克隆[22]及常見內參基因穩定性分析[23]等。梨FWL1是fw2.2的同源基因，其在細胞分裂期的作用，主要負責調控果實的大小，其功能已在番茄、玉米、櫻桃、梨等物種中被預測和鑒定[24]。本研究選用上述的8個常見內參基因為候選內參基因，分別以杜梨（小果型，常用來做砧木）[25]、香梨（中果型）和鴨梨（大果型）果實細胞分裂期的幼果果肉為試材，利用geNorm[26]和NormFinder[27]統計軟件比較分析了各候選內參基因在梨果實細胞分裂期的表達穩定性，旨在篩選出梨果實細胞分裂期合適的內參基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取來源于新疆維吾爾自治區巴音郭楞蒙古自治州沙依東園藝場中樹齡為25 a、樹勢中庸、樹體健康、栽培管理條件一致的杜梨、香梨和鴨梨作為供試材料，分別采集梨花露紅期（對枝條進行套袋處理）、盛花期（對前期套袋處理的枝條進行統一授粉并掛牌標記，授粉品種為碭山酥梨）的花朵，去除子房以上的所有部位（包含柱頭、雄蕊、花瓣），去除花柄；分別采集授粉后10、20、30、40 d的幼果果肉進行研究。每個時期采集30個混合樣本，重復3次，采后立即以液氮速凍，置于-80 ℃的超低溫冰箱中凍存以備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEND，北京）進行總RNA的提取，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸分析儀檢測總RNA的完整性、濃度和純度；以A260/A280之值為1.8～2.1且凝膠電泳條帶清晰的RNA為模板，按照FastKing RT Kit（With gDNase）反轉錄試劑盒（TIANGEND，北京）中說明書的操作方法反轉錄合成cDNA。將合成的cDNA置于-20 ℃的溫度條件下保存以備用。

1.2.2 內參基因的選擇

根據有關文獻[23,28-29]中報道過的候選內參基因，選擇了TUB1、TUB2、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH這8個候選基因作為梨不同發育時期的內參基因。所用引物來源于已報道的文獻中，FWL1來源于TIAN等人[11]的研究結果，所有引物均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成，引物的基本情況見表1。

表1 用于RT-PCR及熒光定量PCR的引物Table 1 Primers for RT-PCR and qPCR

1.2.3 內參基因的普通PCR擴增

以反轉錄合成的cDNA為模板，對8個候選內參基因進行普通PCR擴增，以驗證引物的特異性。反應體系為25 μL，包括10×EasyTaq?Butter 2.5 μL，2.5 mM的dNTPS 2 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L的 上、下游引物各0.5 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 0.3 μL，ddH2O 18.2 μL。反應程序設置：94 ℃，3 min預變性；94 ℃，10 sec變性；57 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共35個循環；最后，72 ℃，5 min延伸；用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.4 內參基因的qPCR擴增

使用BIO-RAD CFX Connect? 熒光定量PCR檢測系統檢測各內參基因的表達情況，使用試劑為Power SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems?Cat：4367659）。使用的PCR程序為：95 ℃，3 min預變性；95 ℃，10 sec變性；55 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共40個循環；之后于65～95 ℃的溫度條件下進行溶解曲線分析，每個樣品均重復3次，根據生成的溶解曲線判斷8個候選內參基因的擴增特異性；并根據獲得的8個基因的循環閾值（Ct值）分析各個候選內參基因在梨果實細胞分裂期的表達情況。

1.2.5 引物擴增效率的計算

根據反轉錄后獲得的cDNA產物濃度，將不同樣品分別稀釋至500 ng/mL，每個樣品取100 μL 并分別稀釋成5個濃度梯度，每個濃度梯度稀釋5倍，最終獲得的標準曲線模板濃度即分別為500.0、100.0、20.0、4.0、0.8 ng/mL，每個反應設3個重復。用BIO-RAD CFX Connect? System進行qRT-PCR反應，獲得Ct值；再利用Excel制作標準曲線，即可獲得相關系數(R2)和擴增效率(E)。

1.2.6 數據分析

采用Excel整理RT-qPCR檢測得到的Ct值，先利用geNorm和NormFinder軟件對8個內參基因的表達穩定性進行統計學分析；以FWL1為目的基因對穩定性不同的4個候選基因（TUB2、Actin1、Actin2和TUB1）進行穩定性驗證，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果分析

2.1 RNA的提取

以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，結果如圖1所示。圖1顯示，28S、18S條帶清晰，以蛋白核酸分析儀檢測到的A260/A280之值為1.8～2.1，說明提取的RNA中沒有蛋白質等物的污染，其完整性良好，符合后續實驗的要求。

圖1 梨總RNA的電泳檢測結果Fig.1 Electrophoretic detection result of total RNA extracted from pear

2.2 候選內參基因引物質量的檢測

對選取的8個候選內參基因進行普通PCR擴增，用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，所用Mark為2 000 bp DNA，擴增產物如圖2所示，其大小與理論大小一致，無特異性擴增產物，其條帶整齊，無引物二聚體。對引物進行標準曲線分析，結果顯示，所有引物均有良好的擴增曲線和溶解曲線，熔解曲線的熔解峰值單一（圖3），通過標準曲線的繪制，可得出qPCR引物的擴增效率為99.89%～111.29%，其相關系數R2值均≥0.99，說明標準曲線線性關系良好（表2）。上述結果表明，8個候選內參基因的引物均符合qRT-PCR引物要求，均可用于梨果實細胞分裂期內參基因的穩定性評價。

2.3 內參基因的Ct值分析

在RT-qPCR分析中，內參基因的Ct值反映了基因的表達量，Ct值越小，說明基因表達量越高，而Ct值越大，基因表達量則越低。不同梨組織中8個候選內參基因的平均Ct值如圖4所示。從圖4中Ct值的分布情況可以看出，TUB1的平均Ct值最小，為18.14，說明其在不同組織樣品中的轉錄水平最高；UBI的平均Ct值僅次于TUB1，為19.61；而TUB3的轉錄水平最低，其平均Ct值最大，為25.99；其他各候選內參基因的平均Ct值均為20～26。這一結果表明，在qRT-PCR分析中，8個候選內參基因存在差異，因此，對8個候選內參基因進行比較分析是十分必要的。

圖2 8個候選內參基因引物的PCR擴增產物Fig.2 PCR products of eight candidate reference genes

圖3 各內參基因的溶解曲線Fig.3 Melting curves of internal reference genes

表2 8種引物的相關系數與擴增效率Table 2 Correlation coefficients and amplification efficiencies of eight primers

2.4 內參基因的表達穩定性分析

2.4.1 以geNorm軟件分析

geNorm軟件分析是通過將Ct值的平均值進行對數轉換后導入軟件中，以基因配對的形式不斷去除最不穩定的基因，最后比較基因表達穩定值（M）的大小來進行候選內參基因穩定性的排序的，其中M值越小，基因的表達穩定性則越強。以geNorm軟件分析得出的8個內參基因的表達穩定值（M）見表3。從表3中可以看出，在總樣本和花期樣本中，各個候選內參基因的表達穩定性從高到低依次為TUB2/Actin1、Actin2、GAPDH、EF1a、UBI、TUB3、TUB1，說明在總樣本和花期樣本中TUB2和Actin1是最合適的內參基因；在果期樣本中，各個候選內參基因的表達穩定性從高到低依次為TUB2/UBI、Actin2、GAPDH、EF1a、Actin1、TUB3、TUB1，說明在果期樣本中TUB2和UBI是最合適的內參基因。對內參基因的配對差異值的分析結果如圖5所示。由圖5可知，在所有樣本中，因Vn/(n+1)（表示配對差異值，式中的n表示內參基因數量）均大于閾值0.15，所以無法確定最合適的內參基因的個數。

圖4 不同梨組織中8個候選內參基因的平均Ct值Fig.4 Mean Ct values of eight candidate internal reference genes of different pear tissues

圖5 以geNorm軟件分析得出的內參基因的配對差異值Fig.5 Obtained pairwise difference values of internal reference genes by using geNorm software

2.4.2 以NormFinder軟件分析

NormFinder軟件的計算原理與geNorm軟件的相似，M值與基因穩定性呈負相關，計算所得的穩定值M越小，說明該基因表達的穩定性就越高，并以M值1.5作為該值的閾值，小于1.5的基因都處于穩定狀態中。以Norm Finder軟件分析所得結果見表4。由表4可知，在總樣本中，TUB2基因的表達穩定值最小，為0.336，說明其表達穩定性最高；在花期樣本中，Actin1基因的表達穩定值最小，為0.237，說明其表達穩定性最高；果期樣本中，TUB2基因的表達穩定值最小，為0.262，說明其表達的穩定性最高。由以上分析結果可知，TUB2在總樣本和果期樣本中的表達均最穩定，均為總樣本和果期樣本中最合適的內參基因；Actin1在花期樣本中的表達最穩定，是花期樣本最合適的內參基因。

2.5 FWL1基因的表達分析

為了驗證所篩選的內參基因在梨果實細胞分裂期中應用的有效性，選擇評價穩定性高的TUB2、Actin1、Actin2和穩定性最低的TUB1為內參基因，對FWL1基因在梨果實細胞分裂期的轉錄水平進行分析，結果如圖6所示。以TUB2為內參基因時，目標FWL1基因在盛花期和授粉后40 d 時均表現出相同的顯著性差異水平，不同梨品種的FWL1基因在露紅期和授粉后40 d時的花托中相對表達量的大小順序分別為：在露紅期，鴨梨＞杜梨＞香梨；在授粉后40 d時，杜梨＞香梨＞鴨梨。以Actin1或Actin2為內參基因時，FWL1的表達模式與TUB2的校正結果大部分一致。然而，以穩定性最差的TUB1為內參基因時，FWL1在不同梨品種同一花期的表達模式與TUB2的校正結果完全不一致。這一分析結果說明，穩定性不同的內參基因可能影響熒光定量PCR分析結果的準確性，甚至會導致分析結論的錯誤。

3 結論和討論

本研究利用qRT-PCR技術分析了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH基因在不同梨品種果實細胞分裂期的表達情況，利用geNorm和NormFinder內參分析軟件對其進行了綜合評估，篩選出了在不同樣本中表達最為穩定的內參基因。在本實驗體系中，TUB2為果期樣本和總樣本的最適內參基因，Actin1為花期樣本的最適內參基因，TUB1在本實驗體系中的穩定性最差，不適合用作梨果實細胞分裂期qRT-PCR分析的內參基因。利用篩選出的內參基因TUB2，分析FWL1基因的表達水平，結果表明：授粉后40 d時果肉中的FWL1基因在小果型梨（杜梨）中的表達水平要高于其在大果型梨（鴨梨）中的表達水平，此結果和FWL1基因與梨果實大小呈反比[11]這一結果相符合，這進一步證實了TUB2作為理想的內參基因可用于梨細胞分裂期的相關基因表達分析。此外，研究中發現，FWL1基因在露紅期花托中的表達水平與果實大小無關，由此推測，FWL1基因與授粉前子房期的細胞分裂無直接關系。

表3 以geNorm軟件分析得出的8個內參基因的表達穩定值Table 3 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using geNorm software

表4 以NormFinder軟件分析所得8個候選內參基因的表達穩定值Table 4 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using NormFinder software

圖6 利用不同內參基因計算得出的FWL1基因在不同梨品種同一時期中的相對表達量Fig.6 Relative expression levels of FWL1 in different pear cultivars during the same stage using different internal reference genes

實時熒光定量PCR技術已經成為分子生物學研究的基本手段[30]，通常選擇表達量恒定的基因作為參照物來對定量PCR分析得出的數據進行歸一化處理，進而減小樣本間的檢測差異[31]。內參基因的選擇不具有通用性，不經過篩選直接選擇某個常見的內參基因很可能使定量分析結果的精確度降低，甚至得到錯誤的結論[2]。前人在梨內參基因上已有一定的研究。陳楊楊等人[32]在對碭山酥梨內參基因的篩選中發現，在高溫和鹽脅迫條件下UBQ在葉片中的表達最穩定，WDP在不同組織器官中的表達均最穩定；張雪等人[33]在對紅梨果皮組織內參基因的篩選中發現，EF-1α和His均可作為紅梨果皮組織qRT-PCR分析的內參基因；Tsuyoshi等人[23]對日本梨的花芽、花器官、果肉、果皮4個組織中的內參基因進行了篩選，結果發現，不同組織需要選取不同的內參基因，這進一步說明，在分析一個新實驗體系中的基因表達情況時，對內參基因的篩選是十分重要的。雖然以上研究對象都是梨，但篩選結果并非某一個通用內參基因。由此可見，在不同的實驗材料和條件下獲得的梨最穩定的內參基因存在差異。geNorm和NormFinder軟件均為目前進行內參基因穩定性評價和驗證的最常使用的軟件，以不同軟件分析得出的這些基因在梨果實細胞分裂期中表達穩定性的排序情況不完全一致，這可能是由不同軟件使用了不同的統計模型所致的[34-35]。以geNorm軟件分析發現，在梨果實細胞分裂期中，Vn/(n+1) 均大于0.15（圖5），楊丹等人[36]也發現了同樣的問題，這可能因為實驗材料來自不同基因型，跨度較大，從而導致了變異系數均大于0.15。

筆者分別以梨果實細胞分裂不同時期的杜梨、香梨和鴨梨為材料，對梨中常用的8個內參基因的表達穩定性進行了研究，分析了在該實驗體系中所選內參基因表達穩定性的差異性。內參基因的種類有很多[37]，本實驗僅篩選了8個內參基因，因此，后續研究應向著擴大內參基因的篩選范圍以及開發新內參基因的方向進行，進一步尋找適合該實驗體系的內參基因，從而為qRT-PCR技術在梨果實細胞分裂期研究中的應用提供重要的基礎資料。