新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物毒性效應的研究進展

張琪，趙成，盧曉霞，于波，黃鈺婷

地表過程分析與模擬教育部重點實驗室，北京大學城市與環境學院，北京100871

新煙堿類殺蟲劑(neonicotinoid insecticides)是全球范圍內最重要的一類殺蟲劑，自20世紀90年代上市后市場份額逐年攀升，2009—2016年期間銷售額的年復合增長率達3.2%，2016年該類殺蟲劑的銷售額為30億美元，占殺蟲劑銷售額的18.2%，占全球農藥市場的5.3%[1]。目前市場上廣泛使用的新煙堿類殺蟲劑主要有7種，根據化學結構可分為3類，即N-硝基胍類(吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺)、N-氰基脒類(啶蟲脒、噻蟲啉)和硝基亞甲基類(烯啶蟲胺)[2]，如圖1所示。吡蟲啉(IMI)是新煙堿類殺蟲劑中第一個成功商業化的產品，上市于20世紀90年代初，烯啶蟲胺(NIT)、啶蟲脒(ACE)和噻蟲嗪(TMX)上市于20世紀90年代中期，而噻蟲啉(THC)、噻蟲胺(CLO)和呋蟲胺(DIN)上市于21世紀初。根據2016年的銷售數據，排名前三的殺蟲劑分別為噻蟲嗪(10.6億)、吡蟲啉(10.2億)和噻蟲胺(3.8億)[1]。吡蟲啉上市早，是新煙堿類殺蟲劑的典型代表，曾常年占據銷售榜首位，后逐漸被噻蟲嗪取代[1,3]。

新煙堿類殺蟲劑是與天然殺蟲劑尼古丁結構相似的合成化合物，其靶向作用于昆蟲中樞神經系統的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)，即由咪唑烷環中的氮原子與昆蟲nAChRs的氨基酸殘基相互作用，阻斷受體并導致昆蟲癱瘓和死亡，這一機制使得新煙堿類殺蟲劑具有較高的選擇性，與傳統殺蟲劑相比對非靶標生物毒性較低[4]。新煙堿類殺蟲劑是廣譜殺蟲劑，對多種重要的經濟作物害蟲(蚜蟲、粉虱、葉蟬、葉甲科昆蟲、線蟲、飛虱、粉蚧和植食性螨等)均具有高活性。新煙堿類殺蟲劑還具有內吸性，它們可以通過植物的根部吸收而后轉移到植物的葉、花和花粉中[5]，該特性一方面有利于通過種子包衣的方式施用新煙堿類殺蟲劑，另一方面也導致生物暴露可能性增加。

圖1 7種新煙堿類殺蟲劑的結構式Fig. 1 Structures of seven neonicotinoid insecticides

由于新煙堿類殺蟲劑被施用后只有一小部分被作物吸收[2]，其他大部分則進入土壤。它們在土壤中具有相對較長的半衰期及較高的淋溶和徑流潛力，能在土壤中積累并隨地表徑流或滲透進入地表水和地下水中[6]。已有不少研究報道了世界各地土壤和水體中新煙堿類殺蟲劑的濃度水平。Wood和Goulson[7]匯總了2013年以來美國、加拿大和歐洲部分國家農業土壤中新煙堿類殺蟲劑殘留的有關研究，得到吡蟲啉的濃度均值范圍是1.62～4.0 ng·g-1，噻蟲嗪為2.4～3.46 ng·g-1，噻蟲胺為2.0～13.28 ng·g-1。中國天津公園和住宅區的土壤樣品中，94.3%含有至少一種新煙堿類殺蟲劑，最常檢出的3種為吡蟲啉、啶蟲脒和噻蟲嗪，它們在公園的濃度均值分別為49.21、6.14和5.82 ng·g-1，在住宅區的濃度均值為19.64、2.20和2.50 ng·g-1[8]。Morrissey等[9]回顧了1998—2013年間來自9個國家的關于水體中新煙堿類殺蟲劑污染水平的29項研究報告，得出地表水中新煙堿類殺蟲劑濃度的幾何平均值為0.13 μg·L-1，濃度峰值的幾何平均值為0.63 μg·L-1。Hladik和Kolpin[10]對美國全國24個州38條河流范圍的水樣進行檢測，發現53%的樣本中至少檢測到一種新煙堿類殺蟲劑，最常檢出的3種依次是吡蟲啉(37%)、噻蟲胺(24%)和噻蟲嗪(21%)，濃度均值分別為12.5、4.59和7.48 ng·L-1。Zhang等[11]測定了中國珠江流域3個干流(東江、北江和西江)地表水的新煙堿類殺蟲劑濃度，噻蟲嗪、噻蟲胺、啶蟲脒和吡蟲啉的檢出率基本接近100%，均值范圍是16.6～31.0 ng·L-1。

除了環境介質，食品中也常檢測到新煙堿類殺蟲劑的殘留。Craddock等[12]收集了在美國農業部農藥數據計劃中獲得的1999—2015年間7種新煙堿類殺蟲劑在各種食物中(包括水果、蔬菜、肉類、乳制品、谷物、蜂蜜和嬰兒食品)的殘留數據，發現所有食品(國內和進口)中新煙堿類殺蟲劑總檢出率最高的是吡蟲啉，為12.0%。對于特定的食品，可觀察到更高的檢測率，如花椰菜中吡蟲啉的檢出率達57.5%，櫻桃中啶蟲脒的檢出率為45.9%。蘋果、芹菜和櫻桃中至少有5%的樣品檢測出2種或多種新煙堿類殺蟲劑的殘留。蔬菜水果中新煙堿類殺蟲劑濃度均值范圍為0.1～5.4 μg·kg-1。Lu等[13]和譚穎等[14]分別研究了中國杭州和北京當地蔬菜水果樣品中新煙堿類殺蟲劑的殘留。杭州樣品中吡蟲啉和噻蟲嗪的檢出率分別為66%和51%，濃度均值分別為3.09 和2.63 μg·kg-1。北京樣品中吡蟲啉和啶蟲脒的檢出率達100%，濃度均值分別為0.98 和1.39 μg·kg-1。

新煙堿類殺蟲劑在環境介質和食品中的殘留對生態系統和人體健康構成威脅。近年來，越來越多的研究關注新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物的生態毒理效應。目前已發現新煙堿類殺蟲劑對水生生物、非靶標昆蟲、鳥類、哺乳動物以及人類都具有一定毒性。本文通過匯總現有文獻，按照物種分類綜述了新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物的毒性效應，并提出研究中亟待解決的問題，以期為新煙堿類殺蟲劑的風險評估和合理施用提供科學依據。

1 新煙堿類殺蟲劑對水生生物的毒性效應(Toxic effects of neonicotinoid insecticides on aquatic organisms)

新煙堿類殺蟲劑對不同種類的水生生物毒性差別較大，可達幾個數量級[9]。Finnegan等[15]研究了噻蟲嗪對水生生物的急性和慢性毒性，研究對象包括6種水生植物、24種水生無脊椎動物(昆蟲、軟體動物和甲殼動物)和5種魚類，觀察到水生植物和魚類是急性毒性測試中不敏感的生物，在所有情況下急性半數致死濃度(LC50)和半數效應濃度(EC50)均≥80 mg·L-1，遠遠超過地表水暴露濃度。對于無脊椎動物，昆蟲最敏感，大多數急性EC50值<1 mg·L-1，部分甲殼類動物(如櫛水虱)表現出與昆蟲相似的敏感性。慢性毒性測試中最敏感的是搖蚊幼蟲，其無觀察效應濃度(NOEC)為0.013 mg·L-1。在Morrissey等[9]的綜述中，對甲殼類動物的急性毒性而言，吡蟲啉和噻蟲啉毒性最高，噻蟲嗪和呋蟲胺最低；在所評估的物種中，鱗翅目、毛翅目和雙翅目的昆蟲最敏感，而甲殼綱昆蟲大多較不敏感。標準測試物種大型蚤(Daphnia magna)耐受程度很高，其對新煙堿類殺蟲劑的敏感度比其他水生無脊椎動物的平均值至少低1 000倍。Gibbons等[16]則通過匯總現有部分研究中魚類的急性毒性數據，發現根據美國環保局的生態毒性分類，新煙堿類殺蟲劑除對虹鱒魚的魚苗為中等毒性外，對其余大部分魚類的毒性為輕微毒性或幾乎無毒。新煙堿類殺蟲劑對水生無脊椎動物的亞致死毒性表現在可影響其攝食、運動等行為和神經系統。Agatz等[17]研究發現，甲殼動物蚤狀鉤蝦(Gammarus pulex)在暴露于濃度大于等于30 μg·L-1的吡蟲啉期間，其攝食受到抑制，并且在轉移到干凈的培養基中3 d后仍沒有恢復；暴露于0.81～9.0 μg·L-1的吡蟲啉，暴露期間對其攝食量沒有顯著影響，但會導致暴露后攝食量增加。在Bownik等[18]的研究中，暴露于啶蟲脒2 h后甲殼動物大型蚤的游泳速度和胸肢活動受到抑制，且這一抑制為濃度依賴性的；在暴露24 h后，低中濃度(25和50 mg·L-1)的啶蟲脒會刺激大型蚤的心率上升，而高濃度(100 mg·L-1)則會使其心率降低，這說明，新煙堿類殺蟲劑能改變大型蚤的行為和生理參數，增加這些動物對更高捕食者壓力的敏感性。Vehovszky等[19]則研究了多種新煙堿類殺蟲劑對軟體動物靜水椎實螺(Lymnaea stagnalis)的神經毒性，發現吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、啶蟲脒和噻蟲啉可以抑制中樞神經系統中VD4和RPeD1神經元之間存在的膽堿能突觸的興奮性反應。

新煙堿類殺蟲劑對魚類的亞致死毒性表現在可誘導魚類出現氧化應激效應、DNA損傷及代謝物水平變化。Yan等[20]和Ge等[21]的研究分別發現，噻蟲嗪和吡蟲啉可以誘導斑馬魚的氧化應激和DNA損傷，且DNA損傷具有明顯的劑量-效應關系。此外，Yan等[22]的研究證明，烯啶蟲胺暴露也會影響斑馬魚肝臟中的抗氧化酶活性，并誘導DNA損傷?？寡趸富钚缘淖兓赡苁潜Ｗo斑馬魚免受烯啶蟲胺誘導毒性的適應性反應。Topal等[23]發現，吡蟲啉可通過抑制虹鱒魚腦組織的乙酰膽堿酯酶(AChE)活性、增加8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)(一種細胞氧化應激的相關標志物)活性和改變氧化應激參數，表現出對虹鱒魚的神經毒性，該研究中吡蟲啉的暴露濃度為10 和20 mg·L-1。在Tian等[24]的研究中，2.0 mg·L-1吡蟲啉暴露也導致中國稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)腦組織中8-OHdG含量增加，但AChE活性增加，2.0 mg·L-1烯啶蟲胺暴露則會抑制AChE活性。高濃度(760和974 mg·L-1)的啶蟲脒暴露可停止斑馬魚中運動神經元系統的發展，這種觀察到的效應可能與斑馬魚中丁酰膽堿酯酶的缺乏有關[25]。此外，新煙堿類殺蟲劑還會影響魚類的代謝平衡。Alam等[26]將一種淡水魚(南亞野鯪Labeo rohita)暴露于濃度為2～3 mg·L-1的啶蟲脒28 d，其血清中鈣、磷酸鹽和白蛋白含量顯著降低，血尿素含量顯著增加。Zhang和Zhao[27]研究發現，亞致死濃度的啶蟲脒誘導了氧化應激、DNA和RNA損傷，抑制了蛋白質合成，使成年斑馬魚頭部、血清和肝臟中氨基酸的含量增加，最終導致尿苷和腺苷積累，擾亂斑馬魚體內氨基酸代謝、三羧酸循環(TCA)循環和神經遞質的平衡。

2 新煙堿類殺蟲劑對非靶標昆蟲的毒性效應(Toxic effects of neonicotinoid insecticides on non-target insects)

有關新煙堿類殺蟲劑對環境影響的關注始于1996年，當時法國養蜂人首次將吡蟲啉的使用與蜜蜂(Apis mellifera)的死亡聯系起來[28]。歐盟食品安全局(EFSA)[29-31]對截至2013年的有關蜜蜂急性口服毒性研究進行了匯總，其中包括同行評議研究以及非公共領域的私人研究，分析得到吡蟲啉的口服半數致死劑量(LD50)為3.7 ng·bee-1，噻蟲胺為3.8 ng·bee-1，噻蟲嗪為5.0 ng·bee-1。EFSA也計算了對蜜蜂的等效的急性接觸毒性，吡蟲啉的LD50為81 ng·bee-1，噻蟲胺為44 ng·bee-1，噻蟲嗪為24 ng·bee-1。此外，含硝基的新煙堿類殺蟲劑(吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪、烯啶蟲胺和呋蟲胺)比含氰基的殺蟲劑(啶蟲脒和噻蟲啉)毒性更大，原因可能是氰基新煙堿類殺蟲劑可快速地被生物轉化[13]。

新煙堿類殺蟲劑通過影響蜜蜂的生殖、行為、學習記憶和免疫能力等表現出對蜜蜂的亞致死毒性。繁殖是確保群體持續存在的重要行為。Whitehorn等[32]開展的大黃蜂(Bombus terrestris)田間暴露研究發現，將蜂群放在田間連續2周進行吡蟲啉經口暴露后，暴露組的生長速率顯著降低，且新蜂王的產量減少了85%。Abbott等[33]發現中高劑量(30和300 ng·bee-1)的吡蟲啉暴露后，果樹壁蜂(Osmia lignaria)幼蟲需要更長的發育時間。新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的神經毒性主要表現為蜜蜂行為和學習記憶能力的改變，進而給蜜蜂的采集活動帶來不利影響，降低蜜蜂的存活能力[34]。高劑量新煙堿類殺蟲劑暴露可能會導致蜜蜂出現顫抖、不協調運動、活動過度和震顫等癥狀而影響蜜蜂的活動性[13]。低劑量暴露則會對蜜蜂的行為產生不同的影響。在Lambin等[35]的研究中，暴露于較低劑量(1.25 ng·bee-1)吡蟲啉的蜜蜂活動性增加，而暴露于較高劑量(2.5～20 ng·bee-1)吡蟲啉的蜜蜂在開放式田間裝置中移動的能力受損。Decourtye等[36]通過半開放式和實驗室內經典喙伸反應實驗發現，吡蟲啉可以降低蜜蜂的嗅覺辨別能力和學習表現，并導致覓食行為減少。在Aliouane等[37]的研究中，長期(11d)接觸低劑量(0.1 ng·bee-1)噻蟲嗪僅會導致蜜蜂短期(24 h)學習記憶減少，而不會造成長期記憶障礙。新煙堿類殺蟲劑也會造成免疫毒性。Di Prisco等[38]發現，亞致死劑量的噻蟲胺降低了蜜蜂內NF-κB免疫信號，對蜜蜂的抗病毒防御系統產生了不利影響。此外，研究發現CYP9Q亞家族的細胞色素P450在確定蜜蜂和大黃蜂對新煙堿類殺蟲劑的敏感性方面至關重要[39]。

部分研究者開展了大型野外實驗探究新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的影響。Henry等[40]將接近亞致死劑量(1 ng·bee-1)的噻蟲嗪置于蜜蜂胸部的微芯片中，在蜜蜂遠離蜂群時逐漸釋放，以模擬實際的暴露情況，發現經處理的蜜蜂在一天中因歸巢失敗而死亡的可能性(高達31.6%)是同類蜜蜂當天自然死亡概率的2倍，這說明，蜜蜂接觸非致命但常見的噻蟲嗪劑量會影響蜜蜂的生存，并可能導致蜂群崩潰綜合征(CCD)。Woodcock等[41]采用大型田間試驗來評估新煙堿類殺蟲劑處理作物對3個國家(匈牙利、德國和英國)蜜蜂的影響，結果顯示，新煙堿類殺蟲劑會導致蜜蜂在暴露后一年內建立新種群的能力降低。為了保護蜜蜂，歐洲已采取相應的禁用政策。2018年4月歐盟通過投票表決，禁止在戶外使用噻蟲胺、噻蟲嗪和吡蟲啉3種新煙堿類殺蟲劑，僅允許用于預期不會與蜜蜂接觸的永久性溫室中。2018年9月1日起，法國禁止銷售與使用5種新煙堿類殺蟲劑(噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲啉和啶蟲脒)，法國成為歐盟首個為保護蜜蜂種群禁用新煙堿類殺蟲劑的國家[42]。

除蜜蜂外，對蝴蝶和家蠶等非靶標昆蟲也有一些研究。家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目的模型昆蟲。在Yu等[43]的研究中，將家蠶暴露于吡蟲啉和噻蟲嗪96 h，所得LC50分別為1.27和2.38 mg·L-1。Phugare等[44-45]先后將家蠶口服暴露于吡蟲啉和啶蟲脒48 h，發現家蠶整體生長緩慢，而且體內出現脂質過氧化(丙二醛顯著增加)、蛋白質氧化速率增加和抗氧化酶活性增加等現象，說明吡蟲啉和啶蟲脒可能通過誘導氧化應激對家蠶產生毒性。此外，彗星試驗結果證實吡蟲啉和啶蟲脒對家蠶具有潛在遺傳毒性。對蝴蝶的毒理學研究極少，但有學者使用蝴蝶種群長期數據集來評估新煙堿類殺蟲劑在農業區使用的相對影響。Pecenka和Lundgren[46]評估了噻蟲胺對帝王蝶(Danaus plexippus)幼蟲的影響，得到一齡幼蟲36 h口服LC50為15.63 μg·L-1，亞致死濃度下一齡幼蟲發育時間延長、體長縮短、體重減輕，但這些差異未延伸到第二齡期。Gilburn等[47]利用1984—2012年期間英國蝴蝶監測計劃得到的各種棲息地內蝴蝶數據，發現在控制天氣影響后，新煙堿類殺蟲劑的使用與蝴蝶種群指數呈顯著的負相關。Forister等[48]則對加利福尼亞州北部低海拔范圍(<25 m)的67種蝴蝶的種群數據進行了統計，數據來源于該區域內4個地點2周一次的監測(分別開始于1972年、1975年和1988年)，發現在控制土地利用和其他因素時，可檢測到的蝴蝶種群數量與新煙堿類殺蟲劑施用量之間存在負相關性，并且這種相關性對于較小體型的物種而言似乎更為顯著。新煙堿類殺蟲劑對蝴蝶的具體毒性機制還需更多研究。

3 新煙堿類殺蟲劑對鳥類的毒性效應(Toxic effects of neonicotinoid insecticides on birds)

由于新煙堿類殺蟲劑對昆蟲nAChRs的親和力大于對脊椎動物的親和力[49]，以往普遍認為它們對鳥類的危害較小。然而，越來越多的證據表明，新煙堿類殺蟲劑在環境濃度下對鳥類具有直接或間接的負面影響。Hallmann等[50]利用2項荷蘭標準化監測方案的數據集，對2003—2009年吡蟲啉在地表水中的平均濃度與2003—2010年鳥類種群趨勢的空間相關性進行評估，發現當地農田鳥類種群的平均內在增長率與吡蟲啉濃度呈負相關，即吡蟲啉可能導致當地鳥類種群數量下降。在吡蟲啉濃度超過19.43 ng·L-1的情況下，鳥類的數量每年平均下降3.5%。這一現象發生的原因除了直接飲水引起的急性毒性外，還可能與施用新煙堿類殺蟲劑導致鳥類食物資源(昆蟲)減少有關。此外，鳥類食用受污染的昆蟲而導致的累積效應也可能造成鳥類數量下降。昆蟲是鳥類尤其是繁殖季節鳥類飲食的重要組成部分，對鳥類養育后代必不可少。類似地，Millot等[51]利用法國的流行病學監測網絡“SAGIR”，發現1995—2014年共有103起檢測到吡蟲啉殘留的野生動物死亡事件。這些死亡動物中灰鷓(Perdix perdix)和鴿子(Columba palumbus、Columba livia和Columba oenas)是主要物種。

實驗室研究表明，吡蟲啉對鳥類具有中度至高度的急性毒性(按美國環保局生態毒性分類)，特別是對于小型物種，如麻雀(Passer domesticus)、金絲雀(Serinus canaria)，對灰鷓(Perdix perdix)的毒性尤其高[15,52]。對斑頰哀鴿(Zenaida auriculata)的研究顯示，吡蟲啉比噻蟲胺和噻蟲嗪的口服急性毒性高70倍，臨床癥狀持續時間也更長[53]。近年來，新煙堿類殺蟲劑對鳥類的慢性毒性和亞致死效應也受到廣泛關注。目前有關鳥類的低反應性、共濟失調、翼下垂、腹瀉、角弓反張(背部嚴重弓形)、睪丸異常、受精率下降、蛋殼厚度及胚胎大小下降、孵化成功率及幼崽成活率下降以及幼崽發育異常等都有報道[6,15]。口服暴露實驗也證實，新煙堿類殺蟲劑對鳥類可產生影響。例如，1 mg·kg-1·d-1的噻蟲胺暴露26 d即導致雄性日本鵪鶉(Coturnix japonica)產生睪丸異常、DNA損傷率增加和胚胎長度減少[54]。將紅腿鷓(Alectoris rufa)暴露于31.9 mg·kg-1·d-1的吡蟲啉10 d，也可直接造成其卵子的受精率降低、鳥蛋的尺寸減小[55]。Lopez-Antia等[56]發現，長時間(25和10 d)低劑量(推薦施用率的20%)的吡蟲啉暴露導致紅腿鷓的血漿生化指標水平降低，血液內超氧化物歧化酶活性增加，首次產卵日期延遲，而且紅腿鷓幼體的T細胞免疫反應降低。Gobeli等[57]則選擇山齒鶉(Colinus virginianus)的卵為實驗對象，定期向其中注射吡蟲啉，發現山齒鶉的胚胎發育受到影響，雛鳥存活率降低。Pandey和Mohanty[58]將紅梅花雀(Amandava amandava)暴露于0.5% LD50的吡蟲啉30 d，發現其甲狀腺的重量、體積和組織病理學明顯改變，表明低劑量殺蟲劑暴露可能會影響甲狀腺的穩態和鳥類的繁殖。為探索新煙堿類殺蟲劑導致鳥類繁殖障礙的機制，2014年研究人員利用鵪鶉為實驗動物研究了噻蟲胺的影響，通過觀察鵪鶉曲細精管中生殖細胞的空泡化程度及具有片段化DNA的生殖細胞數量、肝細胞中空泡數量和大小、卵巢顆粒細胞(產生黃體酮)組織結構以及氧化應激指標谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性，推測新煙堿類殺蟲劑可能通過氧化應激影響生殖系統[59]。表1列出新煙堿類殺蟲劑對各類非靶標生物的急性半數致死濃度(LC50)或半數致死劑量(LD50)。表2列出新煙堿類殺蟲劑對水生生物、非靶標昆蟲和鳥類的亞致死效應。

表1 新煙堿類殺蟲劑對非靶標生物的急性半數致死濃度(LC50)或半數致死劑量(LD50)Table 1 Acute median lethal concentrations (LC50) or lethal doses (LD50) for non-target organisms exposed to neonicotinoid insecticides

注：*括號內為暴露的新煙堿類殺蟲劑，其中，IMI為吡蟲啉，ACE為啶蟲脒，TMX為噻蟲嗪，CLO為噻蟲胺，THC為噻蟲啉，DIN為呋蟲胺。

Note: *The exposed neonicotinoids were shown in parentheses; IMI is imidacloprid; ACE is acetamiprid; TMX is thiamethoxam; CLO is clothianidin; THC is thiacloprid; DIN is dinotefuran.

表2 新煙堿類殺蟲劑對水生生物、非靶標昆蟲和鳥類的亞致死效應Table 2 Sublethal effects of neonicotinoid insecticides on aquatic organisms, non-target insects, and birds

注：IMI為吡蟲啉，ACE為啶蟲脒，TMX為噻蟲嗪，CLO為噻蟲胺，THC為噻蟲啉，NIT為烯啶蟲胺。

Note: IMI is imidacloprid; ACE is acetamiprid; TMX is thiamethoxam; CLO is clothianidin; THC is thiacloprid; NIT is nitenpyram.

4 新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物的毒性效應(Toxic effects of neonicotinoid insecticides on mammals)

哺乳動物的nAChRs廣泛存在于中樞神經系統中，有多種構成形式，既有包含α(α2-α6)和β(β2-β4)亞基的異聚復合物，也有包含α(α7-α9)亞基的同聚復合物，其中α4-β2和α7亞型占優勢[60]。以往認為新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物是低毒性的，但越來越多的研究表明，新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物的影響不容忽視。新煙堿類殺蟲劑在哺乳動物中誘導的毒性可能與α4-β2 nAChRs的激動劑作用和結合親和力有關[49]。截至目前，新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物的毒性研究主要以大鼠、小鼠和兔子為研究對象，內容涉及生殖和發育毒性、神經毒性、遺傳毒性以及臟器毒性效應。新煙堿類殺蟲劑對大鼠急性經口暴露的半數致死劑量為182～>5 000 mg·kg-1[61]，如表1所示。

4.1 生殖發育毒性

新煙堿類殺蟲劑會對大鼠和家兔的生殖系統造成損傷，也會對小鼠和兔胚胎的發育產生不利影響。Bal等[62-65]進行了一系列針對發育中和成年雄性大鼠的實驗，通過口服強飼法用不同劑量的吡蟲啉(0.5、2和8 mg·kg-1·d-1)和噻蟲胺(2、8和32 mg·kg-1·d-1)處理3個月，發現中高劑量的暴露均會對發育中大鼠的生殖系統(附睪重量、精子參數、睪酮水平和生殖細胞等)產生顯著的不利影響。由于高劑量(8 mg·kg-1·d-1)吡蟲啉處理下的大鼠睪丸丙二醛(MDA)和脂肪酸顯著升高而谷胱甘肽(GSH)降低，因此，推斷吡蟲啉對雄性大鼠繁殖的不利影響是由睪丸氧化應激導致的。對于成熟大鼠，高劑量吡蟲啉暴露也會導致生殖系統損傷，但噻蟲胺對雄性大鼠的生殖系統幾乎沒有可檢測到的有害影響。以上結果說明，發育中的大鼠更容易受到吡蟲啉和噻蟲胺的有害影響。類似地，另一研究發現，啶蟲脒也顯著降低了睪丸、附睪、精囊和前列腺等睪酮反應器官的重量以及血清睪酮濃度和精子數量、活力、運動性，并破壞了頂體的完整性。一系列指標顯示，啶蟲脒也是通過誘導睪丸氧化應激損害男性生殖功能[66]。Kapoor等[67]對雌性大鼠口服暴露吡蟲啉90 d，發現高劑量(20 mg·kg-1·d-1)下大鼠卵巢重量減輕，卵泡出現竇卵泡和閉鎖卵泡等顯著病理形態學變化，促黃體激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和孕酮水平也有顯著改變。此外，吡蟲啉也可誘導雄性家兔的細胞間隙增加、睪丸間質細胞數量減少[68]。Babel’ová等[69]的體外實驗表明，將原核期的小鼠胚胎暴露于新煙堿類殺蟲劑(噻蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪和噻蟲胺)溶液中，所有最高濃度(100 μmol·L-1)的新煙堿類殺蟲劑均對小鼠胚胎發育產生負面影響，噻蟲嗪在10 μmol·L-1濃度下也影響胚胎的發育能力；將原核期兔胚胎暴露于噻蟲啉中，在10 μmol·L-1和100 μmol·L-1濃度下均發現胚泡的死細胞百分比增加。

4.2 神經毒性

體內和體外研究均表明，新煙堿類殺蟲劑可誘導發育中和成熟大鼠的神經行為和生化指標發生改變。向妊娠期(妊娠第9天)大鼠腹膜注射吡蟲啉(337 mg·kg-1)，發現出生30 d后的幼鼠出現顯著的感覺運動損傷，這與其腦、皮質、腦干和血漿中的AChE活性增加有關，且幼鼠運動皮質和海馬齒狀回內的膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)表達增加，這一特征是中樞神經系統對各種損傷的修復反應。這些變化可能對后代健康產生長期的不良影響[70]。在Lonare等[71]的研究中，通過口服將成熟大鼠暴露于吡蟲啉(45和90 mg·kg-1·d-1)28 d，發現大鼠的自發運動活動和疼痛閾值顯著降低，且大鼠體內AChE、三磷酸腺苷酶(ATP酶)和血清生化物質水平也顯著降低。Bhardwaj等[72]發現口服暴露于較低劑量(20 mg·kg-1·d-1)吡蟲啉90 d后，雌性大鼠的自發運動活動會降低，腦組織出現輕微的病理學變化，血清和腦中AChE的活性降低。還有研究表明，噻蟲嗪和噻蟲胺可能通過nAChRs誘導大鼠紋狀體的多巴胺釋放，且這一效應具有濃度依賴性[73]。Faro等[74]對其機理進行探究，發現噻蟲胺對多巴胺釋放的影響主要是由胞吐機制、Ca2+、囊泡和TTX依賴性介導的，而不是由多巴胺轉運蛋白介導的。焦慮程度也是神經行為學中評價神經毒性的有效指標。在Rodrigues等[60]的研究中，連續7 d暴露于中高劑量(50、100 mg·kg-1·d-1)的噻蟲嗪會導致大鼠的焦慮行為增加，大鼠海馬突觸體中的高親和力膽堿攝取(HACU)和AChE活性均降低，后者可能是由于噻蟲嗪或代謝物作用于大鼠中樞nAChRs導致膽堿能神經傳遞模式不平衡后的補償機制。Sano等[75]發現，在子宮內和哺乳期內暴露于低劑量的啶蟲脒也可能會特異性地干擾雄性小鼠體內有關社會群體內性關系和焦慮行為的神經回路發展。

體外研究大多基于神經細胞或與之相關的細胞系進行，揭示新煙堿類殺蟲劑的神經毒性機制。Bal等[76]發現，暴露于濃度大于10 mmol·L-1的吡蟲啉，不到1 min即可損害具有nAChRs的小鼠耳蝸核星狀細胞的膜特性，如膜電位的顯著去極化。陳柯[77]的研究顯示，吡蟲啉可以誘導小鼠神經細胞F11細胞系出現細胞萎縮、細胞膜完整性被破壞等細胞凋亡的表現，并干擾F-肌動蛋白的合成及上調乙酰膽堿受體的合成。此外，吡蟲啉還能夠啟動MAPK細胞信號傳導途徑及Nrf2細胞信號轉導途徑，通過后者可提高細胞抗氧化能力。Kimura-Kuroda等[78]的研究表明，吡蟲啉和啶蟲脒對新生大鼠的小腦神經元具有毒性，>1 μmol·L-1的吡蟲啉和啶蟲脒可以誘發顯著的興奮性Ca2+流入，這是神經生理活動轉化為低活性的指標；此外，由于3種nAChRs拮抗劑顯著抑制了由吡蟲啉和啶蟲脒誘導的Ca2+流入，推斷這2種新煙堿類殺蟲劑可能對小腦神經元中的nAChRs具有直接的激動劑活性。在后續研究中，Kimura-Kuroda等[79]仍將新生大鼠的小腦神經元長期(14 d)低劑量(1 μmol·L-1)暴露于吡蟲啉、啶蟲脒和煙堿(作為陽性對照)中，之后進行了轉錄組分析，發現所有暴露組細胞中均有9個神經發育所必需的基因具有顯著差異，表明慢性新煙堿類殺蟲劑暴露以與煙堿暴露相似的方式改變了發育中哺乳動物大腦的轉錄組。Li等[80]研究發現，噻蟲胺和吡蟲啉對人神經元α4β2 nAChRs起到弱激動劑的作用，從而可能對人體產生神經毒性。

4.3 遺傳毒性

目前針對遺傳毒性的檢驗已發展出一些經典的實驗方法，包括彗星試驗、微核試驗、姐妹染色單體交換試驗、染色體畸變試驗和細菌回復突變試驗，其中彗星試驗用來檢測DNA的損傷程度，微核試驗和姐妹染色單體交換試驗用以檢測染色體的改變程度，而細菌回復突變試驗則是用以檢測化合物的致突變性。吡蟲啉、噻蟲啉、噻蟲胺和啶蟲脒均會對哺乳動物產生遺傳毒性。吡蟲啉對哺乳動物的遺傳毒性，郭婧怡等[81]在其綜述中已經進行了較為完善的總結。大多數研究者以人外周血淋巴細胞作為實驗材料，少數以小鼠和兔的體細胞及生殖細胞作為實驗材料。用不同濃度的吡蟲啉進行上述經典試驗，絕大部分試驗結果均有顯著性，吡蟲啉可造成DNA鏈斷裂、細胞微核率和SEC數均上升，說明吡蟲啉具有相當的遺傳毒性。另一相對研究較多的新煙堿類殺蟲劑為噻蟲啉。等[82]分別將大鼠口服暴露于高濃度噻蟲啉(112.5 mg·kg-1·d-1)24 h、低濃度(22.5 mg·kg-1·d-1)30 d后，發現大鼠骨髓細胞的有絲分裂指數(BI)和雙核細胞數都顯著降低，染色體畸變(CA)顯著增加。Kocaman等[83]對人外周血淋巴細胞進行的染色體畸變、姐妹染色單體交換和微核試驗，結果表明，噻蟲啉在實驗濃度(75、150和300 μg·mL-1)條件下均有潛在遺傳毒性。同樣運用上述手段，Galdíková等[84]僅在濃度為120、240和480 mg·mL-1的噻蟲啉暴露中，發現牛外周淋巴細胞DNA損傷的頻率顯著增加，出現不穩定的染色體畸變。此外，在低濃度暴露下谷胱甘肽S-轉移酶M3的表達下降。利用彗星試驗、微核試驗和染色體畸變試驗，研究者發現長時間的噻蟲胺和啶蟲脒暴露，分別對小鼠的外周血紅細胞和體細胞造成遺傳毒性[85-86]。在Calderón-Segura等[87]的研究中，使用2種遺傳毒性參數(尾長和彗星頻率)來評估吡蟲啉、噻蟲啉和噻蟲胺對人外周血淋巴細胞的DNA損傷，發現經不同濃度的新煙堿類殺蟲劑處理2 h后，DNA損傷顯著增加，且具有濃度依賴關系，遺傳毒性最大的為吡蟲啉。

4.4 臟器毒性

新煙堿類殺蟲劑對于哺乳動物的肝臟、腎臟均會產生毒性效應，由于肝臟的主要功能是代謝和消除毒性，因而肝臟是新煙堿類殺蟲劑損傷的主要靶器官[88]。幾項研究表明，高濃度吡蟲啉長期作用于大鼠時，會造成大鼠一系列肝臟的組織學變化，包括肝細胞變性、中央靜脈和血竇的擴張以及肝組織內各種酶水平的變化。Bhardwaj等[72]發現將成年雌性大鼠長時間(90 d)暴露于高濃度(20 mg·kg-1·d-1)吡蟲啉中，大鼠的腦、肝顯示出輕微的病理變化，血清中谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)活性、谷氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)活性、葡萄糖和血尿素氮(BUN)含量顯著升高。Kapoor等[89]通過分析提出，吡蟲啉被吸收、代謝和排泄，顯示為血清酶水平(如GOT和GPT)和生化成分(如膽紅素和BUN)的增加。Toor等[90]和Vohra等[91]在暴露于高劑量吡蟲啉的雌性白化大鼠中均發現了肝組織的病理學變化，包括肝細胞變性、中央靜脈和血竇的擴張，但Toor等[90]發現肝組織中天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)的水平顯著增加，而Vohra等[91]的研究中這一升高并不顯著。另一研究以成年雄性白化小鼠為實驗對象，發現吡蟲啉在暴露劑量達到15 mg·kg-1時，血清的GOT、GPT、堿性磷酸酶(ALP)和總膽紅素(TBIL)水平顯著升高，肝組織出現病理學變化，這表明吡蟲啉對小鼠也具有肝毒性[92]。El Okle等[93]將兔子以250 mg·kg-1的劑量口服暴露于噻蟲嗪90 d，發現噻蟲嗪通過調節氧化/抗氧化狀態和促炎細胞因子(如白細胞介素-6(IL-6)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2))的產生，抑制細胞凋亡和激活細胞生存信號通路，對兔子發揮潛在的肝毒性和促致癌作用。

腎臟是大多數異生素的靶器官，因為近端腎小管細胞能夠在毒性水平積累微酸性和堿性化合物、氨基酸結合物和季胺化合物[94]。有幾項研究表明，新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物具有腎毒性，可造成腎組織的病理學變化和生理生化參數改變。Arfat等[92]和Bhardwaj等[72]研究發現，一定劑量(15和20 mg·kg-1)的吡蟲啉對小鼠也具有腎毒性，導致腎組織發生病理學變化。Ozsahin等[95]研究發現，在亞慢性劑量下口服暴露于吡蟲啉和噻蟲胺90 d后(吡蟲啉和噻蟲胺劑量分別為4和12mg·kg-1)，成年和發育中的雄性大鼠腎組織中脂肪酸、膽固醇和維生素的水平均升高，排泄系統可能在發育早期對于新煙堿類殺蟲劑更為敏感。表3列出新煙堿類殺蟲劑對哺乳動物的亞致死效應。

5 新煙堿類殺蟲劑對人類健康的影響(Influences of neonicotinoid insecticides on human health)

Cimino等[96]匯總了8篇有關新煙堿類殺蟲劑對人類健康影響的文獻，其中4篇關于急性暴露，4篇關于慢性暴露。在急性暴露研究中，一項未觀察到不良影響，3項觀察到了不良影響。在慢性暴露研究中，4項均顯示新煙堿類殺蟲劑暴露與人體不良健康效應之間有良好的相關性。

Elfman等[97]對瑞典19名針葉樹幼苗種植者的研究顯示，人體接觸IMI處理幼苗1周后未有明顯的急性不良反應。Phua等[98]研究了向中國臺灣毒物中心報告的70例暴露病例，其中57例涉及新煙堿類殺蟲劑，主要為IMI(n= 53)，其次為ACE(n= 2)和CLO(n= 2)。10例最嚴重的中毒癥狀均涉及IMI，其中2例死亡。Forrester[99]研究了向美國德克薩斯毒物控制中心報告的1 142例暴露病例，其中77%與IMI有關，17%與DIN有關。最常見的暴露途徑是攝入(51%)，其次是皮膚接觸(44%)。常見的不良臨床反應有眼部刺激(6%)、皮膚刺激(5%)、惡心(3%)、嘔吐(2%)、口腔刺激(2%)、紅斑(2%)和紅眼(2%)。Mohamed等[100]研究了斯里蘭卡68名與新煙堿類殺蟲劑暴露有關的住院患者，其中一名出現呼吸衰竭，另一名因長期鎮靜而接受重癥監護，其余大多數出現輕微癥狀，如惡心、嘔吐、頭痛和腹瀉。患者血液中IMI濃度為0.02～51.25 ng·L-1，中位值為10.58 ng·L-1。

母親在懷孕期間接觸新煙堿類殺蟲劑與不良產出結果之間存在正相關。Carmichael等[101]的一項病例對照(569例心臟缺陷病例和785例對照)研究表明，孕婦在懷孕早期接觸新煙堿類殺蟲劑與新生兒患法洛四聯癥的風險增加有關。Yang等[102]根據加利福尼亞州圣華金谷的73例無腦病例(6例暴露，67例未暴露)研究發現，母親居住區靠近吡蟲啉使用區與無腦病發生相關。在Keil等[103]的研究中，自閉癥兒童產前暴露于吡蟲啉的幾率略高于對照(407例自閉癥病例和262例對照)。此外，對新煙堿類殺蟲劑施用者的健康影響也有研究。Koureas等[104]發現80名新煙堿類殺蟲劑施用者全血中DNA氧化損傷的誘導與殺蟲劑使用頻率有關。Hernandez等[105]對89名新煙堿類殺蟲劑施用者和25名非施用者的呼吸功能進行了測定和比較，發現殺蟲劑的施用與肺功能紊亂(總肺容量、殘余體積和功能性殘余容量較低)有一定相關性。Marfo等[106]基于對35名未知出身的癥狀患者與50名非癥狀志愿者的研究發現，尿液中N-去甲基-啶蟲脒的濃度與神經癥狀(包括失憶、手指震顫和頭痛等)患病率有一定相關性。

6 結語和展望(Summary and outlook)

新煙堿類殺蟲劑對水生生物、非靶標昆蟲、鳥類和哺乳動物等多種非靶標生物都具有致死效應和亞致死效應，且不同物種之間差異較大。從總體毒性看，吡蟲啉最高，其次為啶蟲脒、噻蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺，呋蟲胺和烯啶蟲胺較低。在對不同物種的研究中，吡蟲啉的毒性都最高，呋蟲胺和烯啶蟲胺的都較低，急性LC50或LD50相差幾倍至幾十倍。啶蟲脒、噻蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺的毒性大小順序隨物種不同而不同。例如，對于水生生物和非靶標昆蟲，噻蟲啉和噻蟲胺的毒性較高，而對于鳥類和哺乳動物，啶蟲脒的毒性較高。應當指出的是，實驗結果通常會受多種因素影響。即便對于同一物種，實驗條件如暴露濃度、時間和方式等都會對結果產生影響。因此，上述結論還需更多的研究進行驗證。

注：IMI為吡蟲啉，ACE為啶蟲脒，TMX為噻蟲嗪，CLO為噻蟲胺，THC為噻蟲啉。

Note: IMI is imidacloprid; ACE is acetamiprid; TMX is thiamethoxam; CLO is clothianidin; THC is thiacloprid.

雖然歐洲已經開始部分禁用新煙堿類殺蟲劑，但在世界范圍內新煙堿類殺蟲劑的市場占有率仍然很高，這意味著各種非靶標生物仍會暴露于該類殺蟲劑中，因而生物安全受到威脅。目前對新煙堿類殺蟲劑生物毒性的研究還存在不足。例如，研究對象多為水生生物、非靶標昆蟲、鳥類和哺乳動物，對其他非靶標生物研究較少。已有研究對毒性效應表征較多，對致毒機理探究較少；對單一化合物暴露較多，對多個化合物聯合暴露較少。此外，如何將模式動物和體外細胞的實驗結果外推到人，目前還未見報道。對人群的暴露研究中，定性數據較多，實量數據較少。今后應在如下幾方面加強研究：(1)新煙堿類殺蟲劑對其他非靶標生物如土壤節肢動物、非靶標食草動物、兩棲及爬行類動物等的毒性效應；(2)結合多種分析手段在不同水平上研究新煙堿類殺蟲劑對不同物種生物的致毒機理；(3)多種新煙堿類殺蟲劑或與其他農藥聯合暴露時對不同物種生物的毒性效應與機理；(4)模式動物和體外細胞實驗結果外推至人的可靠方法，以及人群暴露評估的可靠方法。這些研究有助于進一步為新煙堿類殺蟲劑的風險評估和合理施用提供科學依據。