浮游動物物種構成對于淡水測試系統抗農藥脅迫能力的影響

徐吉洋，張文萍，李少南

浙江大學農藥與環境毒理研究所，杭州 310058

農藥產品的生態風險主要取決于2個方面：一是農藥產品在環境介質中沉積量和沉積范圍，二是其對非靶生物的危害。出于經濟和時效方面的考慮，農藥危害鑒定試驗目前大多分步驟、分層次進行。如果初評能夠排除農藥產品的生態風險，試驗過程即可終止；反之則需要開展高層次試驗[1-3]。方法之一是擴大物種測量范圍，構建物種敏感度分布(SSD)曲線[4-5]。SSD曲線的使用無疑會降低風險評估中“假陰性”結論的出現概率。然而SSD曲線賴以建立的基礎是依據個體試驗。眾所周知，以個體試驗的結果來評判農藥在種群或群落層次的危害，其結論往往并不可靠。正如按照經濟合作與發展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD)制定的OECD 202[6]開展溞類急性毒性試驗而得到的48-h EC50難以被用來判斷農藥在種群層次的危害，更談不上對相關的群落演替的影響。OECD 202中的48 h試驗[6]如此，OECD 211中的21 d試驗[7]同樣如此，可見對于初評呈“陽性”的農藥產品，開展種群或群落試驗十分必要。

在種群或群落層次開展農藥危害性測試，需要建立相應的系統。這就涉及物種的選擇。筆者嘗試構建包含隆線溞(Daphnia carinata)、鋸緣真劍水蚤(Eucyclops serrulatus)和中華薄殼介(Dolerocypris sinensis) 3種甲殼動物當中的1種或全部，以及包含小球藻(Chlorella vulgaris)、萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)和輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)的4組測試系統。溞、劍水蚤、介形蟲和輪蟲之所以被選用，主要是因為它們時常出現在同一水域[8-10]，藻可以作為食物被上述浮游動物當中的部分或全部物種所取食[11-13]，水草可以抑制藻在測試系統內過度生長[14]。本研究選擇有機磷殺蟲劑毒死蜱作為受試農藥。毒死蜱應用范圍廣，其對淡水測試系統的影響已有不少研究[15-21]，是考察農藥直接和間接效應的理想化學品。本研究的主要目的包括：(1)了解物種構成對于淡水測試系統群落結構穩定性的影響；(2)了解物種構成不同的測試系統在抗農藥脅迫能力上的差別。

殼二糖酶(chitobiase)編號EC 3.2.1.52，又被稱為?-N-乙酰己糖胺糖苷酶(?-N-acetylhexosaminidase)，或被稱為N-乙酰氨基葡萄糖胺糖苷酶(N-acetylglucosaminidase)，是有能力水解?-1,4-糖苷鍵(?-1,4-glycosidic bonds)的酶類。節肢動物在生長過程中需要經歷多次脫皮，脫皮過程需要殼二糖酶的參與[22]。水生節肢動物在每次脫皮之后會將其富含殼二糖酶的脫皮液釋放到水中，動物個體越大數量越多，單位時間內釋放到水中的殼二糖酶的量就越多[23-25]。Duchet等[26]和Qi等[27]分別研究了多殺菌素、除蟲脲和吡蟲胍對溞類種群殼二糖酶釋放量的影響，結果顯示，隨著農藥對種群的壓制，介質中殼二糖酶的比活性也有所下降。筆者將游離態殼二糖酶作為一項測量指標，希望探明其作為農藥種群脅迫指示因子的功效。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試農藥

毒死蜱(chlorpyrifos)，化學名稱為O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，由浙江新農化工有限公司提供，純度97%。

1.2 受試物種

本文所涉及的隆線溞(Daphnia carinata)屬于溞科(以下簡稱溞water fleas)、鋸緣真劍水蚤(Eucyclops serrulatus)屬于劍水蚤科(以下簡稱劍水蚤cyclops)、中華薄殼介(Dolerocypris sinensis)屬于金星介科(以下簡稱介形蟲seed shrimps)、萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)(以下簡稱輪蟲rotifers)以及(羅氏)輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)均采自浙江大學華家池校區人工池塘。溞和輪蟲用小球藻飼養，劍水蚤和介形蟲用輪蟲飼養。小球藻(Chlorella vulgaris)購自中國科學院淡水藻種庫并按其提供的配方營養液進行飼養。

1.3 測試系統構成和組建

采用能夠容納2 L稀釋液的玻璃燒杯。施藥前26 d將輪葉黑藻植入試驗容器。水草取莖尖以下約7 cm，先植入25 mL小燒杯。小燒杯底部鋪上1 cm厚的泥炭。上面覆蓋3 cm厚的石英砂(30目)。每1只小燒杯植入1株水草。每只試驗容器內放3只植入水草的小燒杯。以OECD M4營養液作為稀釋水。配方參見OECD211中附件2[7]。其中，除了CaCl2、MgSO4、KCl和NaHCO3，微量元素的濃度是原配方的3倍。植入水草的同時(施藥前26 d)將稀釋水引入試驗容器。通過預實驗得知系統中氮、磷濃度隨著時間的延續呈下降趨勢，因此自施藥前23 d開始，每隔3 d向每只試驗容器內補充濃度為1 200 mg·L-1的KH2PO4和濃度為7 000 mg·L-1的KNO3各0.5 mL。共構建4組測試系統。前3組系統當中只包含1種節肢動物。第4組同時包含溞、劍水蚤和介形蟲。

給藥前18 d接種小球藻(接種密度約105cells·mL-1)。給藥前7 d接種浮游動物。輪蟲接種密度為0.35 只·mL-1(相當于每只試驗容器接種約700只)。給藥前4 d接種節肢動物。溞、介形蟲和劍水蚤每只試驗容器各接種25只。分別從施藥前6 d和3 d開始向第4組測試系統內補充藻和輪蟲，每隔3 d向每只試驗容器內補充1 mL濃度為7×106cells·mL-1的藻液，每隔3 d向每只試驗容器內補充700只。

1.4 溫度和光照

將系統置于溫度24～27 ℃和光照強度3 500～2 200 lx條件下進行培養，每日光照16 h。

1.5 給藥

試驗共設1個對照組和5個濃度組。每組設3個重復。根據預試驗的結果，對于“溞”系統，毒死蜱添加濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、2.5和12.5 μg·L-1，對于其他3組測試系統，毒死蜱添加濃度分別為0、0.05、0.25、1.25、6.25和31.25 μg·L-1。由于受試農藥水溶解度有限，先用丙酮將其溶解配成初級母液，再用丙酮將初級母液稀釋成系列濃度的次級母液。用微量注射器量取初級或次級母液50 μL加入各試驗容器。

1.6 采樣

使用美國材料與試驗協會(American Society for Testing and Materials, ASTM)制定的ASTM E 1366-02中推薦的柱狀取水器采集水樣[28]。每只試驗容器每次采樣100 mL。采樣規程如表1所示。試驗容器內因采樣和揮發而損失的稀釋液用無離子水加以補充。

用270目濾網濾除浮游動物，剩下的水樣過0.22 μm醋酸纖維素濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)，供水質指標和殼二糖酶活性測量之用。

1.7 樣品測量

1.7.1 浮游動物

隆線溞以及體型較大的介形蟲和劍水蚤肉眼可見，輪蟲以及體型較小介形蟲和劍水蚤肉眼難以分辨。鑒于此，借助體視顯微鏡(日本Nikon，SMZ1500)和浮游動物計數框(德國HYDRO-BIOS，435 010)對于水樣內浮游動物進行計數。為減少對測試系統的干擾，計數后的浮游動物及水樣盡量返還。

表1 采樣規程Table 1 Sampling schedule

注：1)以施藥當天作為0 d。

Note:1)To take date of pesticide application as 0 d.

1.7.2 水質指標

被測量的水質指標包括pH、電導率、總氮、總磷、銨態氮(NH4-N)和濁度。pH測量采用GB 6920—1986的方法[29]；電導率測量采用DZ/T 0064.6—93的方法[30]；總磷測量采用GB/T 11893—1989的方法[31]；總氮測量采用GB/T 11894—1989的方法[32]；NH4-N測量采用GB/T 7479—1987的方法[33]；濁度測量采用GB 13200—91的方法[34]。

1.7.3 殼二糖酶

以4-甲基傘形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-?-D-glucosaminide, MUF-NAG)作為底物，采用熒光分光光度法進行測量[35]。具體方法如下：向96孔聚苯乙烯板中加入150 μL經過0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾后的水樣(作為酶源)，加入50 μL含0.31 mmol·L-1MUF-NAG的0.15 mol·L-1檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH=5.5)，在25 ℃下溫育1 h，用50 μL 0.25 mol·L-1NaOH終止反應。作為空白，向水樣中同時加入底物和NaOH，其余步驟同前。采用熒光酶標儀(美國MD，GEMINI xps)在激發波長360 nm和發射波長450 nm下測量酶的產物發出的熒光。用水解產物4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone, MUF)建立標準方程。將測量結果帶入方程求出單位體積水樣在單位時間內生成MUF的量。

1.7.4 水草

試驗結束時將輪葉黑藻取出，測量其主根和主莖長度，對于側根和側莖進行計數，最后稱量濕重并加以記錄。

1.8 數據處理

單變量分析(包括回歸分析和差異顯著性分析)采用DPS?[36]；多變量分析采用排序軟件CANOCO 5的主成份分析(principal component analysis, PCA)模塊[37]。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 浮游動物

浮游動物在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統中的變化趨勢如圖1、圖2和圖3所示。圖4顯示上述浮游動物在“多節肢動物”系統中的變化趨勢。從圖1、圖2和圖3中可以看出，浮游動物在3組測試系統中的變化趨勢各有不同：溞先升后降，介形蟲持續上升，劍水蚤先升后降然后再上升。從圖4中可以看出，節肢動物在該系統中先上升然后保持相對平穩。輪蟲在該系統中的變化趨勢也是先升后降，但是下降速度較圖1、圖2和圖3緩慢。

以浮游動物的群密度作為應變量，以受試農藥添加濃度作為解釋變量，對數據組做PCA，結果如圖5所示。從解釋變量和應變量箭頭在圖5中的走向上看，毒死蜱對各系統中溞、介形蟲和劍水蚤的影響均為負，對輪蟲的影響則并不一致。以單個物種為目標做PCA，結果顯示，毒死蜱在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統中對輪蟲的影響均為負(影響率分別為<0.1%、0.5%和0.2%)；在“多節肢動物”系統中，毒死蜱對輪蟲的影響為正(影響率為35.1%)。

圖1 “溞”系統內的隆線溞(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～12.5 μg·L-1)的種群動態注：圖中每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 1 State of D. carinata (a) and B. calyciflorus (b) in “water flea” systems being exposed to chlorpyrifos (0～12.5 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

圖2 “介形蟲”系統內的中華薄殼介(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動態注：圖中每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 2 State of D. sinensis (a) and B. calyciflorus (b) in “seed shrimp” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

圖3 “劍水蚤”系統內的鋸緣真劍水蚤(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動態注：圖中每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 3 State of E. serrulatus (a) and B. calyciflorus (b) in “cyclop” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

2.2 水質指標

pH、電導率、總氮、總磷、NH4-N和濁度等6項水質指標在“溞”、“介形蟲”、“劍水蚤”和“多節肢動物”系統中的變化趨勢分別如圖6、圖7、圖8和圖9所示。在4組測試系統中，總氮、總磷和濁度總體呈下降趨勢(總磷在有些系統的中間過程中有波動)，電導率總體呈上升趨勢，pH變化不大(在“多節肢動物”系統中，該指標有上升趨勢)，NH4-N前升后降(在“多節肢動物”系統中的下降不充分)。

為鑒定農藥對上述6項指標的影響，以單項指標測量結果作為應變量，以受試農藥添加濃度作為解釋變量，對數據組做PCA，結果如表2所示。就影響性質而言，毒死蜱在各系統之間具有相似性；就指標而言，毒死蜱促進了系統內pH、NH4-N和電導率水平的上升以及總氮、總磷和濁度水平的下降。這在“多節肢動物”系統中尤為明顯。

2.3 水草

試驗結束時對“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統內各株輪葉黑藻的生長指標進行了測量。以測量結果作為應變量，以受試農藥添加濃度作為解釋變量，對數據組做PCA，結果如圖10所示。從圖10中可以看出，除了濕重，農藥對大部分生長指標(主根、主莖、側根和側莖)有負面影響，農藥對濕重的影響在系統之間有所差異。

圖4 “多節肢動物”系統內的浮游動物在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動態注：圖中每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 4 State of zooplanktons in “multi-arthropod” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

表2 針對水質指標測量結果的非限制性排序Table 2 Unconstrained ordination for result of measurements for selected water-quality indexes

注：1)“+”表示解釋變量對應變量有正面影響，“-”表示解釋變量對應變量有負面影響；2)“Ⅰ”表示溞+輪蟲測試系統，“Ⅱ”表示介形蟲+輪蟲測試系統，“Ⅲ”表示劍水蚤+輪蟲測試系統，“Ⅳ”表示多節肢動物+輪蟲測試系統。

Note:1)“+” means a positive impact of supplementary variable(s) on response variable; “-” means a negative impact of supplementary variable(s) on response variable;2)“Ⅰ” means water flea+rotifer test system; “Ⅱ” means seed shrimp+rotifer test system; “Ⅲ” means cyclop+rotifer test system; “Ⅳ” means multi-arthropod+rotifer test system.

2.4 殼二糖酶

殼二糖酶在4組測試系統中的比活性變化趨勢如圖11所示。可以看出，殼二糖酶的比活性在“溞”系統中先升后降，在“介形蟲”系統中持續上升，在“劍水蚤”系統中先升后降然后再上升，在“多節肢動物”系統中先上升然后保持相對平穩。這與節肢動物在圖1～圖4中的變化有相似之處。以浮游動物在水體中的豐度作為應變量，以游離態殼二糖酶比活性作為解釋變量，對數據組做PCA，結果如圖12所示。可以看出，殼二糖酶與節肢動物之間的協同關系比較明顯，與輪蟲之間的協同關系不明顯。

圖5 毒死蜱對浮游動物的影響注：X和Y軸上所標的數值代表坐標軸的相對長度；X和Y軸上所標的數值絕對值越大，變量的變化率越大；括號中的百分數表示解釋變量引起的變化在應變量總變化中所占的比例。Fig. 5 The effects of chlorpyrifos on zooplanktonsNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables.

圖6 “溞”系統內部分水質指標在毒死蜱暴露下(0～12.5 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 6 Change in some water quality indexes in “water flea” systems being exposed to chlorpyrifos (0～12.5 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

3 討論(Discussions)

3.1 農藥對生物指標的影響

3.1.1 浮游動物

PCA結果顯示，本研究中建立的“多節肢動物”系統能夠揭示毒死蜱對于輪蟲的誘導。這種誘導在野外發生的頻率很高[15-17]。根據現有資料，溞和輪蟲之間存在食物競爭關系[38-39]，劍水蚤和輪蟲之間存在捕食與被捕食關系[40-41]，同樣的關系也存在于介形蟲和輪蟲之間[42]。可以設想在作為食物競爭者的溞和作為捕食者的介形蟲和劍水蚤受到毒死蜱壓制的情形下，輪蟲得到一定程度的恢復。在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統中，輪蟲因受到溞、介形蟲和劍水蚤的高強度壓制而過快下降，其恢復潛力得不到正常發揮。這提示，維持測試系統群落結構的相對穩定對于農藥效應，特別是間接效應的測量十分重要。本研究的結果顯示，在維持穩定方面“多介質動物”系統優于“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統。

對于圖5對應的各組系統，提取后臺數據CaseR.1(即應變量在第1軸上的分值)，對它們在各處理組之間的差異做多重比較，結果如表3所示。

注：1)每組用“/”隔開的字母(或字母組合)顯示對6個處理所對應的CaseR.1(即樣品在第1軸上的分值)做多重比較的結果；6個處理分別是CK、0.05、0.25、1.25、6.25和31.25 μg·L-1。以相同字母(或全部或部分相同的字母組合)代表的CaseR.1被視為相同(即P≥0.01)，以不同字母(或完全不同的字母組合)所代表的CaseR.1被視為不同(即P<0.01)；與CK不同的標為灰色；2)NOEC為最高無作用濃度，LOEC為最低有效濃度；以連續2次不同于對照作為LOEC成立的前提[43]，括號中的數值表示效應持續的時間。

Note:1)Each group of letter (or letter combination) separated by “/” indicated a result of multiple comparison of CaseR.1 (i.e. sample score at the first axon) corresponding to six treatments, i.e. CK, 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 μg·L-1; the values of CaseR.1 represented by same letter (or letter combination of the same or partly the same) are considered the same statistically (i.e. P≥0.01), whereas the values of CaseR.1 represented by different letter (or letter combination totally different) are statistically different (i.e. P<0.01); the CaseR.1 that was different from CK are painted grey;2)NOEC means maximal no observed effect concentration; LOEC means lowest observed effect concentration; the LOEC could not be recognized unless it lasted for a period of two successive times or more[43]; that enclosed in the brackets were the time lasting for the effect.

圖7 “介形蟲”系統內部分水質指標在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 7 Change in some water quality indexes in“seed shrimp” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

從表3中可以看出，在“介形蟲”和“劍水蚤”系統中，對于“介形蟲+輪蟲”和“劍水蚤+輪蟲”組合，在給藥之后(2～35 d)采集60個樣品，其中分別有14個和9個不同于對照；在“多節肢動物”系統中，對于相應的組合，在給藥之后(2～32 d)采集60個樣品，其中分別有23個和18個不同于對照。可見在感受毒死蜱脅迫方面，“多節肢動物”系統比“介形蟲”和“劍水蚤”系統更靈敏。此處未對“多節肢動物”和“溞”系統中的“溞+輪蟲”組合進行比較，原因是溞和輪蟲在2個系統中的受脅迫水平不同(它們分別是0、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μg·L-1和0、0.05、0.25、1.25、6.25、31.25 μg·L-1)。

作為一種應用廣泛的殺蟲劑，有關毒死蜱對淡水生態系統及浮游動物影響的研究較多。Daam等[16]在室外測得毒死蜱對浮游動物群落(包含3種溞、7種輪蟲、劍水蚤(未分類)、哲水蚤(未分類)、介形蟲(未分類)、橈足類無節幼蟲和原生動物(砂殼蟲))的LOEC為100 μg·L-1；López-Mancisidor等[17]在室外測得毒死蜱對枝角類(8種)、橈足類(3種)、輪蟲(24種)的LOEC分別為1 μg·L-1；可見兩者之間存在差異。在室內，Daam和van den Brink[44]測得毒死蜱對浮游動物群落(包含6種溞、11種輪蟲、介形蟲(未分類)、劍水蚤(未分類)和昆蟲(蜉蝣))的LOEC為0.05 μg·L-1；van Wijngaarden等[45]測得毒死蜱對包含2種溞、3種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤、橈足類無節幼蟲、纖毛蟲、太陽蟲的“地中海”群落，對包含4種溞、11種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤的“溫帶”群落，以及對包含7種溞、5種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤、橈足類無節幼蟲的另一“地中海”群落的LOEC均為1 μg·L-1。表3顯示毒死蜱對浮游動物群落(包含溞、介形蟲、劍水蚤和輪蟲)的LOEC為1.25 μg·L-1，可見本研究所構建的“多節肢動物”系統抗農藥脅迫能力適中。

圖8 “劍水蚤”系統內部分水質指標在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 8 Change in some water quality indexes in “cyclop” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

3.1.2 水草

本研究的4組測試系統中均接種了輪葉黑藻。一是防止單細胞藻類在試驗過程中可能出現的過度生長[14]，二是為介形蟲之類的浮游動物提供適宜生長的環境[46]。有關殺蟲劑對水草影響的研究目前鮮有報道。在陸生植物方面，人們發現如毒死蜱這樣的殺蟲劑能夠影響綠豆(Vigna radiata)植株的氮代謝[47]并有可能引起植株的氧化損傷[48]。Bertrand等[49]以屬于沼生目(Helobiae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)的小眼子菜(Potamogeton pusillus)作為受試植物，測量毒死蜱對植株抗氧化指標的影響，發現農藥在極低濃度(3.5～94.5 ng·L-1)之下即可引起植株抗氧化反應。在本研究中，筆者僅測量了水草在試驗結束時的生長情況，并未測量水草在試驗過程中的變化，因此無法確定毒死蜱對水草的影響閾值。鑒于水草在維持系統穩定方面的重要性，其抗農藥脅迫能力理應得到人們的關注，這方面還需要更加細致的研究。

3.2 農藥對水質指標的影響

作為一種應用廣泛的殺蟲劑，已有不少研究考察了毒死蜱對淡水生態系統的影響，包括對于水質指標的影響。然而正如表4所示，這些研究的結果似乎并不一致。PCA結果顯示，毒死蜱對于測試系統內pH和NH4-N水平的上升以及總氮和總磷水平的下降有促進作用(表2)。其中，NH4-N的上升可能與浮游動物在農藥脅迫下對NH4-N釋放量增加有關[50-51]。pH升高的現象在以往研究中也有報道，這預示系統內的光合作用得到毒死蜱的促進[18,44-45]。二嗪農[18]這樣的殺蟲劑有類似功效，莠去津[43]和利谷隆[52]這樣的除草劑則相反。考慮到水質變化的生態學意義，有關農藥對水質的影響，今后還應深入研究。

圖9 “多節肢動物”系統內部分水質指標在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個點代表3個測定結果的平均值。Fig. 9 Change in some water quality indexes in“multi-arthropod” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

表4 有關毒死蜱影響測試系統水質的文獻研究結果1)Table 4 Reports from previous researchers concerning impacts of chlorpyrifos on quality of water in test systems 1)

注：1)“+”表示正面影響；“-”表示負面影響；“0”表示無影響；“/”表示未測量。

Note:1)“+” means a positive impact; “-” means a negative impact; “0” means no impact; “/” means not measured.

圖10 毒死蜱對輪葉黑藻的影響注：X和Y軸上所標的數值代表坐標軸的相對長度；X和Y軸上所標的數值絕對值越大，變量的變化率越大；括號中的百分數表示解釋變量引起的變化在應變量總變化中所占的比例。Fig. 10 The effects of chlorpyrifos on Hydrilla verticillataNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables.

圖11 測試系統中游離態殼二糖酶在毒死蜱暴露下的比活性變化注：圖中的每1個點代表3個測定結果的平均值；(a)為“溞”系統，給藥濃度0～12.5 μg·L-1；(b)為“介形蟲”系統，給藥濃度0～31.25 μg·L-1；(c)為“劍水蚤”系統，給藥濃度0～31.25 μg·L-1；(d)為“多節肢動物”系統，給藥濃度0～31.25 μg·L-1。Fig. 11 Change in specific activity of free-living chitobiase in systems being exposed to chlorpyrifosNote: Each spot in the figures represented average of three measurements; (a) represents “water flea” systems, with administrative concentrations of 0～12.5 μg·L-1; (b) represents “seed shrimp” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1; (c) represents “cyclop” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1; (d) represents “multi-arthropod” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1.

3.3 殼二糖酶

表2右起第1列顯示“多節肢動物”系統內各處理組殼二糖酶比活性差異多重比較結果。從中可以看出，毒死蜱對酶指標的最高無作用濃度(NOEC)和最低有效濃度(LOEC)分別為0.25和1.25 μg·L-1，LOEC延續時間>32 d，這與計數獲得的結果(表2右起第2列)比較一致，說明酶指標能夠用來指示農藥對浮游動物群落的影響閾值。

為量化殼二糖酶與節肢動物之間的協同關系，筆者仍以“多節肢動物”系統為例，以殼二糖酶比活性作為解釋變量，以肢動物豐度作為應變量制作散點圖并且建立回歸方程，結果分別如圖13和表5所示。從點對點的角度，自變量與應變量之間存在協同關系(圖13(a))。方程A的R2=0.7563，F=330.5602，P=0.0000。從時段對時段的角度，自變量與應變量之間的協同關系明顯改善(圖13(b))。方程B的R2=0.9655，F=209.9833，P=0.0000。

節肢動物在生長過程中不斷向水中釋放酶，被釋放的酶又不斷被降解。如果種群處于平衡狀態，酶的釋放率與降解速率相等。基于這一假設，人們常以酶在移除節肢動物的水體中的降解率來衡量節肢動物的種群繁殖率[53-55]。也只有在這種狀態下，酶的比活性才能夠以較小偏差來指示種群豐度。相反如果節肢動物種群處于擴張(或萎縮)狀態，動物的豐度會被高估(或低估)。

從圖4中可以看出，以給藥后第8天為界，之前動物大約處于擴張狀態，之后它們趨于穩定。為此分別以殼二糖酶比活性和節肢動物豐度在-4～8 d和8～32 d的測量結果(平均值)作為解釋變量和應變量制作散點圖(圖13(c)和13(d))并得到回歸方程(表5中的方程C和D)。對比方程B和D，可以看出方程B對動物的豐度有所高估。這正是由于動物在前期的擴張引起的。可見要想提高殼二糖酶作為農藥脅迫指示因子的可靠性，所構建的測試系統需要維持穩定。

從系統穩定性以及系統對殺蟲劑脅迫的直接和間接反應上看，本研究所構建的“多節肢動物”系統相比只包含1種節肢動物的測試系統更能夠準確衡量農藥對浮游動物的生態脅迫。

圖12 浮游動物豐度變化與殼二糖酶活性變化的關系注：X和Y軸上所標的數值代表坐標軸的相對長度；X和Y軸上所標的數值絕對值越大，變量的變化率越大；括號中的百分數表示解釋變量引起的變化在應變量總變化中所占的比例；浮游動物(節肢動物和輪蟲)在“多節肢動物”系統內的豐度以其在單位體積內的生物量(μg·(100 mL)-1)作為衡量依據，隆線溞、中華薄殼介、鋸緣真劍水蚤和萼花臂尾輪蟲的個體生物量分別以1.32、0.659、0.0674和0.0473 μg·只-1進行計算；它們在另外3個系統內的豐度以種群密度(只·(100 mL)-1)作為衡量依據。Fig. 12 The relationship between change in abundance of zooplanktons and change in activity of chitobiaseNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables; abundances of zooplankton (arthropods and rotifer) were scaled with biomass per volume (μg·(100 mL)-1) in “multi-arthropod” systems; the biomass of D. carinata, D. sinensis, E. serrulatus, and B. calyciflorus was counted as 1.32, 0.659, 0.0674, and 0.0473 μg·individual-1, respectively; those in other three systems were scaled with population density (individuals·(100 mL)-1).

表5 殼二糖酶活性與節肢動物生物量在“多節肢動物”系統中的協同關系Table 5 Correlation between activity of chitobiase and biomass of arthropods in “multi-arthropod” systems

注：1)數據來源時段；2)“x”為殼二糖酶在稀釋液中的比活性(μmol·h-1·L-1)，“y”為節肢動物的單位生物量(mg·(100 mL)-1)；“x”和“y”在方程A中意指-4～32 d之內的任何一個時間點上的測定值，在方程B中意指-4～32 d之內12個時間點上的測定結果的平均值，在方程C中意指-4～8 d之內5個時間點上的測定結果的平均值，在方程D中意指8～32 d之內8個時間點上的測定結果的平均值。

Note:1)Time period for collection of the data;2)“x” is activity of chitobiase in dilutions (μmol·h-1·L-1); “y” is biomass of arthropods population in dilutions (mg·(100 mL)-1); either “x” or “y” is a measurement at any point of time from -4 to 32 d in Equation A, an average of measurements at 12 points of time from -4 to 32 d in Equation B, an average of measurements at 5 points of time from -4 to 8 d in Equation C, and an average of measurements at 8 points of time from 8 to 32 d in Equation D.

圖13 殼二糖酶和生物量在“多節肢動物”系統內的變化Fig. 13 Change in chitobiase and biomass in “multi-arthropod” systems

致謝：本項研究中的溞和劍水蚤由南開大學生命科學學院王新華教授鑒定，介形蟲由華東師范大學生命科學學院禹娜教授鑒定。在此一并致謝！