BDE-28對斑馬魚核受體介導的內分泌干擾效應研究

宋靜文，靳亞茹，劉紅玲

南京大學環境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210023

2,4,4’-三溴聯苯醚(2,4,4’-tribromodiphenyl ether, BDE-28)作為高溴代多溴聯苯醚(PBDEs)代謝中間產物之一[1]，曾在長江三角洲沉積物中PBDE類物質中檢出相對豐度最高(14%)，超過了2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether, BDE-47)[2]。BDE-28等低溴代聯苯醚還曾在我國海產品中檢出并且含量相對較高[3]。在長江下游的16種水生生物群包括蟹類、蝦類以及各種魚類的樣本均檢測到BDE-28的存在，占所有檢出的PBDEs比例相對較高(10.9%)，這大大超過了國外的檢出頻次和濃度[4]。BDE-28在水環境中的廣泛檢出使其可能對水生生物造成潛在危害，應該引起重視。

PBDEs的發育毒性和核受體介導內分泌干擾效應已在嚙齒類動物和水生脊椎動物中得到了廣泛的研究，這些研究主要側重在高溴代同系物如BDE-47和BDE-99等，相比較之下低溴代的BDE-28的研究則較少，但是BDE-28同樣會對一些水生生物甚至人類健康產生有害影響。例如有研究發現，BDE-28會導致斑馬魚胚胎發育異常并且對人類嬰幼兒的神經發育功能也有負面效應[5-6]，有研究表明，在非洲綠猴腎細胞(CV-1)中BDE-28(100 nmol·L-1)可增強三碘甲狀腺氨酸(T3)誘導甲狀腺激素受體β(trβ)的激活，但對甲狀腺激素受體α(trα)的激活沒有增強作用[7]。此外，已有文獻報道人類體內甲狀腺激素(TH)濃度與體內BDE-28濃度相關[8]。然而，到目前為止關于BDE-28在魚類等水生脊椎動物體內與核受體相互作用的研究較少，所以本文選擇斑馬魚為模式生物，對其8個重要受體(包括雄激素受體(AR)、甲狀腺激素受體(TR)、芳香烴受體(AhR)、雌激素受體(ER)、糖皮質激素受體(GR)、孕烷X受體(PXR)、鹽皮質激素受體(MR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR))及其相關基因展開研究。結合計算模擬方法來研究BDE-28對斑馬魚幼魚的作用，通過分子對接研究BDE-28是否能與核受體的配體結合域(ligand-binding domain, LBD)結合，進行分子動力學模擬，進一步研究BDE-28與斑馬魚相關核受體之間的相互作用。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

BDE-28(純度>99.2%)，購自美國AccStandard公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)分析純，購自上海捷瑞生物工程有限公司，作助溶劑；RNA抽提試劑盒(RNeasy?Mini Kit)購于Qiagen公司；cDNA逆轉錄試劑盒(Omniscript RT Kit)購自Thermo公司；實時定量PCR試劑盒(SYBR?Real time PCR Master Mix Plus Kits)購自日本Toyobo公司。

1.2 斑馬魚胚胎收集及暴露實驗[9]

AB型成年斑馬魚(7月齡)在斑馬魚半自動養殖系統中培養，胚胎收集和暴露參照以前實驗[9]。簡要敘述如下：將BDE-28的DMSO母液梯度稀釋成系列暴露液(2、20和200 μg·L-1)，DMSO不超過暴露液體積的0.1%。將胚胎(4 hpf)進行3個濃度3個平行暴露并配制0.1%的DMSO為對照。在120 hpf對斑馬魚幼魚取樣，用RNAlater試劑固定樣品，貯存于-20 ℃低溫冰箱中備用。

1.3 定量實時聚合酶鏈式反應(q-RT-PCR)實驗[10]

使用RNA抽提試劑盒提取各濃度組培養的斑馬魚幼魚樣品的總RNA，然后逆轉錄成cDNA。最后使用SYBR實時定量PCR試劑盒對逆轉錄后的cDNA進行靶基因的擴增和測定。q-RT-PCR反應條件為：95 ℃變性10 min并擴增至40個循環，之后降溫到60 ℃保持60 s。以持家基因18S rRNA作為mRNA的表達內參，基因表達的變化用空白對照組進行標準化并通過2-ΔΔCT方法計算。采用Graphpad Prism 7軟件使用單因素方差分析(ANOVA)方法并隨后通過多重比較Tukey檢驗方法分析實驗組與對照組基因調控倍數之間的顯著性差異，當P<0.05時表示存在顯著性差異。

1.4 結構模型準備

在ChemDraw內構建BDE-28的分子結構，利用Sybyl 7.3軟件賦予BDE-28分子Gasteiger-Hückel電荷[11]和Tripos分子力場[12]并使其能量最小化，選擇Powell方法設置1 000次迭代，使化合物的能量收斂到0.01 kcal·(mol·nm)-1。優化后的化合物結構作為后續分子對接的初始結構。從Uniport網站(www.uniport.org)下載斑馬魚核受體氨基酸序列信息，選擇具有一致性且無斷鏈的結構作為模板，在SwissModel工作站(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)通過同源模建方法，構建斑馬魚LBD域的初始形態[13]。

1.5 核受體通路的構建

根據之前的研究構建8種核受體相關通路[14]。對于與AhR和ER通路相關的基因，利用安捷倫文獻檢索軟件，在Cytoscape軟件v3.1.1中構建生物相互作用網絡[15]。其他6個核受體通路的基因網絡通過WikiPathways網站(http://www.wikipathways.org/)和SABioscien-ce基因網絡中心(http://www.sabiosciences.com/genenetwork/genenetworkcentral.php)檢索獲取，并與AhR和ER通路整合關聯，通過Cytoscope將其可視化為一個基因網絡。在這個網絡通路只顯示出被研究的基因，根據不同濃度中基因表達的顯著調控倍數，用Cytoscape中的Enhanced Graphics模塊對生成的網絡基因(節點)進行著色。

1.6 分子動力學模擬

利用Sybyl 7.3軟件的Surflex-Dock模塊將能量最小化的BDE-28小分子對接進斑馬魚受體LBD域。在分子對接中，采用Automatic模式搜索對接口袋，其中閾值(Threshold)和膨脹系數(Bloat)分別設置為0.5和0(默認值)[16]。通過分子對接得到配體的10個對接構象，選取打分值最高的構象作為活性構象并將之與受體結合組成復合物，在南京大學計算機中心的刀片式服務器上用Gromacs-5.1.4軟件包進行分子動力學模擬。在模擬過程中對受體分子賦予CHARMM27力場，配體小分子的力場參數使用SwissParam平臺(http://www.swissparam.ch/)處理。以距離蛋白質-小分子配體表面至少2 nm構建盒子，填充TIP3P水分子，即蛋白質與溶劑邊緣至少有1 nm，并加入Na離子或Cl離子以平衡體系電荷。在進行動力學模擬前，系統先經受5 000步的能量最小化。然后進行2個階段平衡：以NVT和NPT來平衡系統。每個系統在NVT系綜中被模擬為500皮秒(ps)，在能量最小化的情況下從0到300 K逐漸加熱，并且在NPT系統中保持300 K平衡500 ps。模擬中利用Particle Mesh Ewald(PME)算法計算電相互作用，范德華力以1 nm截斷半徑。最后進行10 ns的MD模擬，所有模擬步長設置為2飛秒(fs)，并每2 ps記錄一次運動軌跡[17]。利用OriginLab軟件對骨架原子的均方根偏差(root-means-square deviation, RMSD)進行分析。

2 結果(Results)

2.1 BDE-28對斑馬魚關鍵核受體通路調控的影響

根據之前的研究[14]，八大受體中心基因網絡中涉及41個基因。轉錄結果表明，斑馬魚胚胎暴露于BDE-28后導致AR、TR和AhR及相關基因發生顯著性下調，而ER及相關基因表達發生顯著性上調。

如圖1和圖2所示，暴露在2、20和200 μg·L-1的BDE-28下的AR(ar)基因分別顯著下調，下調倍數為3.03、2.64和10.10，與AR相關的增殖相關蛋白基因2G4-b(pa2g4b)、β-連環蛋白(ctnnb1)只在200 μg·L-1的BDE-28處理下發生顯著下調，且下調倍數分別為3.30和4.43，在較低濃度(2、20 μg·L-1)下這些基因的表達沒有明顯變化。然而，增殖相關蛋白2G4-a(pa2g4a)基因在3個暴露濃度下都發生了顯著下調，在由低到高暴露濃度(2、20和200 μg·L-1)下的下調倍數分別為3.77、2.58和2.01。核受體共激活因子4(ncoa4)基因在2、20和200 μg·L-13種濃度下的下調倍數分別為4.81、3.42和5.68。斑馬魚幼魚trα基因在2、20和200 μg·L-1暴露下的下調倍數分別為2.21、2.18和2.31，與TR相關的核受體共抑制因子2(ncor2)基因也在低中高3種暴露濃度下下調，下調倍數分別為4.23、3.93和14.69。

圖1 斑馬魚中8個受體通路相關基因相互作用的網絡關系圖和BDE-28暴露對基因表達的影響注：每個節點代表一個基因，連線代表蛋白和蛋白或蛋白和DNA的相互作用關系；紅色代表基因顯著上調(P<0.05)，而綠色代表基因顯著下調(P<0.05)。Fig. 1 Interaction network shows the relationship among genes associated with eight receptor pathways of zebrafish and the expression of these genes after exposure to BDE-28Note: Nodes represent single genes, and edges indicate either protein-protein or protein-DNA interactions; the red color represents significant up-regulation (P<0.05) and the green color represents significant down-regulation of genes (P<0.05).

圖2 8個核受體通路的基因表達情況火山圖注：虛線X=-1左側和X=1右側的點分別代表下調倍數為2以上和上調倍數為2以上的基因；虛線Y=1.30以上的點表示基因表達量與對照組有顯著性差異(P<0.05)；AR表示雄激素受體，TR表示甲狀腺激素受體，AhR表示芳香烴受體，ER表示雌激素受體，GR表示糖皮質激素受體，PXR表示孕烷X受體，MR表示鹽皮質激素受體，PPARα表示過氧化物酶體增殖物激活受體。Fig. 2 Volcano plot of gene expression profiles in each nuclear receptor pathwayNote: The dotted lines on the left of X=-1 and on the right of X=1 represent genes that are down-regulated by more than 2-fold and up-regulated by more than 2-fold, respectively; points above the dotted line Y=1.30 indicate significance (P<0.05); AR stands for androgen receptor; TR stands for thyroid hormone receptor; AhR stands for aryl hydrocarbon receptor; ER stands for estrogen receptor; GR stands for glucocorticoid receptor; PXR stands for pregnane X receptor; MR stands for mineralocorticoid receptor; PPARα stands for peroxisome proliferator activated receptor.

此外，斑馬魚AhR與其調控的相關基因也發生了顯著變化(圖1和圖2)。芳香烴受體基因(ahr2)和細胞色素P4501a1(cyp1a1)在暴露于2和20 μg·L-1的BDE-28之后顯著下調，下調倍數分別為12.65、9.23和8.33、4.35，而在最高濃度下兩者都沒有顯著變化。芳香烴受體核轉位蛋白2(arnt2)和芳香烴受體抑制因子b(ahrrb)分別只在最低濃度和最高濃度下下調，下調倍數為2.19和3.50，而在其他暴露濃度無顯著變化。雌激素受體(er1)基因在3個暴露濃度下都發生了顯著上調，在由低到高濃度下的上調倍數分別為12.29、12.67和15.87。雌激素受體(er2a)基因在2和20 μg·L-1的BDE-28下的上調倍數分別為10.83和17.19，但在最高濃度下其調控水平沒有受到影響。相反，er1的下游基因孕酮受體基因(pgr)和卵黃蛋白原2(vtg2)在2、20和200 μg·L-1相較于對照組顯著下調，倍數分別為3.29、2.55、3.45與4.98、3.36、3.24。BDE-28的基因影響不呈劑量效應關系。除此之外，暴露在濃度為200 μg·L-1的BDE-28下使斑馬魚GR顯著下調，倍數為17.05，較低濃度下沒有觀察到下調現象。3種暴露濃度下沒有發現PXR、MR和PPAR核心受體調控有顯著的變化。

2.2 BDE-28與核受體的對接和分子動力學模擬

圖3顯示了經拉氏圖驗證模建的蛋白結構良好。將BDE-28與AR、TR、AhR和ER這4個受顯著影響的核受體進行分子對接及分子動力學模擬研究。對接結果顯示，BDE-28成功地與斑馬魚AR、TR、AhR和ER的LBD域對接。進一步進行分子動力學模擬來觀察斑馬魚AR、TR、AhR和ER受體和配體結合的動態過程，模擬時間為10 ns。5 ns之后，4個受體-配體復合物趨于穩定，復合物RMSD在5 ns后平均波動小于0.2 nm(圖4)。對于AR，其H12鏈在5 ns之后保持穩定(圖4)，H12鏈呈現“鼠夾”現象(圖5)。在動力學模擬過程中，配體和受體復合物出現“鼠夾”現象時，化合物可以被初步判斷為有活性。從圖6(a)可以看到，BDE-28在受體口袋中被PHE764、MET749、MET787、MET745、MET42、LEU873、LEU704、PHE876、MET780、LEU880和VAL889氨基酸殘基包圍并通過和這些氨基酸殘基形成疏水鍵與AR穩定的結合。

分子對接模擬的結果同樣也表明，BDE-28能夠與斑馬魚TR、AhR和ER快速穩定地結合。比如TR(圖6(b))，BDE-28位于對接口袋的中心且穩定地保留在結合位點上，一個苯環位于殘基ALA266、LEU277、LEU290、ILE302和LEU279形成的疏水區域中，另一個苯環位于殘基ILE225、PHE408、LEU295、PHE404、PHE218、PHE221和PHE388形成的疏水區域中，這些氨基酸殘基與配體的苯環和Br原子形成疏水鍵。此外，BDE-28的氧原子還與氨基酸殘基HIS384形成氫鍵(鍵長0.2816 nm)，這表明，BDE-28能在核受體LBD域內穩定地與受體蛋白結合并且發生相互作用。TR與BDE-28復合物的RMSD的波動數值在5 ns之后小于0.2 nm(圖4)，表明配體-受體復合物已經趨于穩定。此外，BDE-28與AhR和ER的動力學模擬結果如圖4和圖6(c)和(d)所示，且BDE-28與AhR和ER只存在疏水相互作用，沒有氫鍵生成。

3 討論(Discussion)

暴露于2、20和200 μg·L-1的BDE-28主要改變了4個核受體(AR、TR、AhR和ER)信號通路的基因表達，其中，AR和TR信號通路受影響最大。在3種濃度BDE-28處理下斑馬魚幼魚AR和ncoa4表達均顯著下調，說明BDE-28是一種AR拮抗劑，并可能干擾魚類體內的睪丸素產生[18]。在最高濃度下pa2g4b和ctnnb1以及ncoa2基因明顯下調，低中濃度下pa2g4a基因表達下調，這可能干擾了斑馬魚的生長調節信號。之前有毒性研究發現，BDE-28會對斑馬魚幼魚的生長發育造成影響[5]。作為BDE-47在魚類體內的代謝產物，BDE-28結構式與母體化合物相差一個Br原子，這可能使BDE-28在干擾生物體內生殖激素的分泌及信號通路傳導方面有相似的作用，從而影響有機體的生殖與發育功能。研究表明，BDE-47可與AR產生拮抗作用[19-20]。與BDE-47觀察到的效應類似，BDE-28主要抑制了ctnnb1和ncoa4的表達。ctnnb1作為Wnt信號通路的細胞內信號傳感器，可以直接結合轉錄因子并作用于早期胚胎，在身體一些發育過程中起核心作用[21]。睪丸中共激活因子ncoa4的表達可以調節AR對精子形成的調控，精子形成是一個雄激素與AR相互依賴的過程。有研究顯示，男性體內精子數量、睪丸功能和睪丸大小均和體內的PBDEs含量相關[22]。之前有研究表明，BDE-47可減少日本青鳉魚體內精子濃度[23]；最近也有研究表明，暴露在室內灰塵中的BDE-28可能會影響人類男性精液質量[24]。本研究結果表明，BDE-28也可能通過AR介導對斑馬魚產生內分泌干擾作用。

圖3 模建斑馬魚核受體配體結合域(LBD)的拉氏圖Fig. 3 Ramachandran plot of modeled zebrafish nuclear receptors (NRs) ligand-binding domain (LBD)

圖4 骨架原子(AR)的H12鏈以及受體配體復合物的均方根偏差(RMSD)注：RMSD波動在5 ns之后<0.2 nm。Fig. 4 The root mean square deviation (RMSD) for backbone atoms of H12 (AR) and receptor-ligand complexNote: The relative fluctuations of complex is less than 0.2 nm after 5 ns.

圖5 雄激素受體出現的“鼠夾”機制Fig. 5 The “mousetrap” mechanism of androgen receptor

圖6 斑馬魚(a)AR、(b)TR、(c)AhR、(d)ER核受體結合位點的關鍵氨基酸殘基注：紅色組分代表化合物BDE-28，綠線代表氫鍵。Fig. 6 The key amino acids residue of the nuclear receptor binding sites of zebrafish (a) AR, (b) TR, (c) AhR and (d) ERNote: The red component represents compound BDE-28, and green line is hydrogen bonds.

有研究表明BDE-28會影響人體內的甲狀腺功能[25]，另有研究證明孕婦體內血清中的BDE-28濃度與TH水平呈負相關[26]。而從本研究結果可以看出，斑馬魚經過BDE-28暴露后trα受到影響，明顯下調，這說明BDE-28可能會作用于TR。從圖1可以看出，ncor2在3個濃度下都顯著下調，其作為一種核受體共抑制因子同時也是一種轉錄相關調節蛋白，包含多個與核受體相互作用域，已被證明和TR、AR有相互作用[27]。此外，ncor2有將組蛋白脫乙酰基酶招募到DNA啟動子區域的功能，并協助核受體下調靶基因表達[28]。TR對三碘甲腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)是高親和力受體，它影響到身體生理發育的幾乎每一個過程，包括生長、代謝、體溫和心率等[29]。此前對斑馬魚的研究表明，在BDE-47暴露后T4含量顯著下降而T3含量顯著上升[30]。BDE-28可能由于其結構與BDE-47相似，影響了與TR及相關的基因表達，改變了斑馬魚TH水平，顯示BDE-28可能會造成斑馬魚的甲狀腺功能紊亂。

此外，BDE-28對斑馬魚ahr2的影響呈非劑量效應關系，rhrrb和arnt2分別只在最高和最低濃度下有顯著下調，這可能是由于斑馬魚早期生命階段有著更高的敏感性。雌激素受體er1和er2a顯著上調，之前也有學者研究倉鼠卵巢細胞發現，BDE-28在er1和er2a檢測中表現出激動活性[31]。然而，vtg2基因卻在3個濃度下明顯下調。卵黃蛋白原是卵黃的前體蛋白，可與脂類、磷酸鹽、糖和金屬離子結合，為卵黃生物胚胎發育提供必需的營養和能量，卵黃蛋白原基因(vtgs)的誘導表達被看作卵生脊椎和無脊椎動物暴露于類雌激素物質的分子生物標志物。這些結果說明，AhR-ER“串擾”作用的機制十分復雜，因此，在評估環境污染物的雌激素效應的過程中，對BDE-28通過影響ER產生的內分泌干擾效應有待更多的實驗數據去支持驗證。在本研究中，斑馬魚GR只在200 μg·L-1的BDE-28濃度下下調，顯示BDE-28引起的內分泌干擾效應可能涉及到GR信號通路。

本研究過程通過分子對接和分子動力學模擬來證實體內實驗AR、TR、AhR和ER分析的結果。由于目前斑馬魚受體的晶體結構尚未被解析，因此使用同源建模來構建斑馬魚AR、TR、AhR和ER的LBD域初始形態。分子動力學研究中，通過觀察AR的H12鏈和4個受體與BDE-28復合物的穩定性，以及配體在受體活性位點部位與關鍵氨基酸殘基成鍵作用，顯示BDE-28可以穩定地與這些受體相互作用。核受體通路上相關基因調控變化的實驗結果表明，BDE-28可能是斑馬魚AR、TR、AhR的拮抗劑和ER的激動劑。該研究手段可以為眾多污染物的內分泌干擾效應篩查提供借鑒，研究結果可為BDE-28的風險管控提供毒理信息。