基于TCGA數據庫及轉錄組數據分析HDAC1基因在胃癌中的表達和臨床意義*

李抄，陳定宇，張曉怡，趙艷，王琴容，周建獎，鮑麗雅，謝淵**

(1.貴州醫科大學 地方病與少數民族性疾病教育部重點實驗室，貴州省醫學分子生物學重點實驗室，貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附院 感染科 肝炎實驗室，貴州 貴陽 550004)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球發病率第4位的惡性腫瘤，在腫瘤中致死率居第2位，是最常見的癌癥類型之一[1]。GC的傳統治療方法有胃切除術和放化療，但其復發率和死亡率很高，5年總生存率(overall survival，OS) 低于25%[2-3]。GC的發生發展是一個多階段多因素參與的過程，幽門螺桿菌(helicobacterpylori,H.pylori)毒力因子、眾多的細胞因子及信號通路在其中扮演重要角色[4]，因此，尋找與GC早期診斷、治療和預后密切相關的新靶點一直是近年來研究的熱點。細胞毒素相關基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,CagA)是H.pylori的主要毒力因子，是已知的唯一注入胃上皮細胞的癌蛋白，可引起正常細胞分化的修飾，改變細胞極性和細胞黏附，與炎癥反應增加、消化性潰瘍和GC發生的風險有關[5-7]。本課題組前期用CagA轉染胃上皮細胞轉錄組分析發現，cagA基因可引起組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)表達增高。有研究發現HDAC1在人GC細胞中高表達，且與預后相關[8]；組蛋白乙酰化/去乙酰化調控是表觀遺傳學中研究的主要內容，HDAC1催化組蛋白去乙酰化反應，下調組蛋白乙酰化水平，可使染色質被壓縮成致密構象，轉錄活性下降[9]；組蛋白乙酰化/去乙酰化水平的失衡或其調節酶的異常與GC發生、發展存在密切的聯系[10]。這些研究提示HDAC1可能作為GC臨床預后評估的指標以及靶向治療的新靶點。因此，本研究通過對癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)公共數據庫，分析HDAC1 mRNA在GC組織和正常胃組織中的表達差異，分析GC中HDAC1表達水平量與臨床病理特征參數的相關性，預測HDAC1可能的相關信號通路及參與的功能富集，為GC發生發展的作用機制提供研究線索。

1 資料與方法

1.1 資料

從TCGA數據庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中下載并預處理GC數據集中444例標本的HDAC1 mRNA表達RNASeqV2數據，其中正常胃組織且HDAC1 mRNA表達量正常樣本36例作為正常組，408例GC組織樣本中再篩選出性別、年齡、瘤體大小(T1、T2、T3、T4) 、淋巴結轉移(N0、N1、Nx) 、遠處轉移(M0、M1、Mx)及美國癌癥聯合會(American Joint Committe on cancer ，AJCC)病理特征分期完整的371例作為GC組。GC組男239、女132例，年齡≤60歲122例、>60歲249例，T1+T2期53例、T3+T4期318例，N0期113例、N1期112例及Nx期146例，M0期326例、M1期24例及Mx期21例，Stage I+Stage II 51例、Stage III+Stage IV 320例；正常組男23例、女13例，年齡≤60歲7例、>60歲122例。此外，按GC組患者HDAC1 mRNA表達量均值大小將GC組分為高表達組(高于均值)271例和低表達組(低于均值)100例，一般資料見表1。

1.2 方法

1.2.1HDAC1相關基因篩選 登錄LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org/)首頁，選擇腫瘤類型為“GC”，靶點為“HDAC1”，數據集選擇TCGA數據集，分析與HDAC1表達相關的基因。

1.2.2基因功能富集分析(Omicsbean-Canner) 利用 Omicsbean-Canner V1.0網站(http://www.omicsbean.cn/)按照網站操作步驟對HDAC1基因進行GO Enrichment分析，包括Molecular Function、Biological Process及Cell Component 富集結果等，進一步結合既往對GC研究的靶點基因，選取有意義的信號通路。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HDAC1基因表達量

GC組標本HDAC1基因平均表達量(5.29±0.55)，明顯高于正常組(4.59±0.63)，差異有高度統計學意義(t=6.88，P<0.01)，見圖1。

注：(1)與正常組比較，P<0.01。圖1 GC組與正常組被檢者HDAC1基因表達Fig.1 HDAC1 differential expression in GC and normal subjects

2.2 GC組HDAC1 mRNA基因表達與臨床病理參數的關系

HDAC1 mRNA基因高、低表達組GC患者間的臨床病理參數比較結果顯示，HDAC1 mRNA基因的表達高低與患者的年齡、T分期、AJCC分期及幽門螺桿菌(H.pylori)感染等病理參數呈正相關性(P<0.05)，但與性別、N分期及M分期等病理參數無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 GC患者HDAC1 mRNA基因表達水平與臨床病理參數的關系Tab.1 Correlation of HDAC1 mRNA gene expression level and clinicopathological parameters in patients with GC

2.3 GC組HADC1 mRNA表達與預后

對TCGA數據集中GC患者的預后進行Kaplan-Meier分析，繪制生存函數曲線，結果表明，HDAC1 mRNA高、低表達與GC患者生存無相關性(P>0.05)，見圖2。

圖2 HDAC1高、低表達組GC患者預后的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of overall survival in GC patients with HDAC1-high and -low expression groups

2.4 GC組HADC1相關基因分析

使用LinkedOmics數據庫對GC組HADC1進行相關基因分析，以P<0.05為界限，共檢索到HADC1基因表達與AK2(adenylate kinase 2)、EIF3I(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I)及MARCKSL1(MARCKS like 1)等9 118個基因表達量呈正相關，與GNAL(G protein subunit alpha L)、ARMCX2(armadillo repeat containing X-linked 2)及CCDC46(centrosomal protein 112)等10 907個基因表達量呈負相關，見圖3。

2.5 HDAC1的功能基因富集分析

Omicsbean-Canner功能富集分析結果表明，HDAC1基因功能顯著富集到細胞周期、notch信號通路及Transcriptional misregulation in cancer等，見圖4。

3 討論

GC作為一種高發惡性腫瘤，給人民群眾的健康帶來了巨大的威脅，也給社會帶來了沉重的負擔[11]。雖然GC的診斷和治療技術有了持續進展，但GC的發病機制仍未完全闡明[12]。因此，尋找新的靶點對于GC的診斷和治療有著重要的意義。TCGA組學數據庫有著樣本量大、數據信息豐富完整及隨訪時間長等優點；因此得到的結論較為可靠，有利于充分認識基因在腫瘤發生發展中的作用[13-14]。通過生物醫學大數據分析，可以為進一步研究基因在腫瘤的功能和調控機制奠定基礎。

注：A 為HDAC1關聯結果，B為正相關基因，C為負相關基因。圖3 HADC1相關基因分析Fig.3 HADC1-related gene analysis

圖4 HADC1基因的功能富集Fig.4 The functional enrichment of HADC1 gene

乙酰化作用在真核細胞的轉錄調控中起核心作用。在細胞核內，組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化過程處于動態平衡；并由組蛋白乙酰化轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同調控[15]。HAT將乙酰輔酶A的乙酰基轉移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上，HDAC使組蛋白去乙酰化，與帶負電荷的DNA緊密結合，染色質致密卷曲，基因的轉錄受到抑制[16]；HDAC還參與調節組蛋白乙酰化水平，組蛋白乙酰化也可能作為一種信號，傳達信息改變相鄰核小體上組蛋白之間的功能狀態，影響組蛋白與轉錄因子間的作用，HDAC與HTA共同作用維持細胞內乙酰化與去乙酰化的平衡狀態，如這一平衡被打破可能導致疾病發生[17-18]；HDAC抑制劑已被應用于臨床治療惡性腫瘤，有越來越多的研究證實HDAC抑制劑能夠誘導不同的腫瘤細胞增殖停滯、細胞分化、凋亡等。

本研究發現，GC組標本HDAC1基因平均表達量明顯高于正常組，差異有高度統計學意義(P<0.01)，提示HDAC1可能是GC中的一個重要的促癌基因；進一步分析HDAC1與GC患者臨床特征的關系，結果顯示HDAC1基因的表達水平與患者的年齡、T分期、AJCC分期及H.pylori感染呈正相關(P<0.05)，但與性別、N分期及M分期無相關(P>0.05)，以上結果表明HDAC1基因高表達可能是GC的預后一種不利因素。為了進一步探索HDAC1在GC中可能的作用機制，本研究通過LinkedOmics數據庫分析HDAC1密切相關的基因，結果顯示HDAC1表達與AK2、EIF3I及MARCKSL1顯著正相關，與GNAL、ARMCX2及CCDC46 顯著負相關，EIF3I的體外過表達導致細胞大小增加，增殖增強，細胞周期進程和錨定非依賴性生長，EIF3I過表達促進mTOR(mechanistic target of rapamycin)將生長信號整合到mRNA翻譯過程中，從而促進蛋白質合成和腫瘤生長[19-20]，MARCKSL1在細胞凋亡的調節中起著關鍵作用，并已顯示出維持抗腫瘤和轉移抑制的特性[21-22]，以上可能為HDAC1潛在的上下游分子。在Omicsbean-Canner中以HDAC1基因目標顯著富集到細胞周期、notch信號通路、Transcriptional misregulation in cancer等信號通路及功能。有研究發現Notchl信號通路過表達可能參與胃黏膜的癌變過程，而且Notchl的表達與GC惡性程度負相關,表明Notch信號通路在GC組織中的雙重效應[23-26]，推測CagA可能通過HDAC1高表達途徑來調控細胞周期及Notch信號通路等來促進GC的進展。

綜上所述，本研究通過對TCGA數據庫基因芯片數據庫的數據挖掘，可知HDAC1基因在GC中呈高表達，并與GC患者的年齡、T分期、AJCC分期及H.pylori感染顯著相關，與預后無相關。然而本研究也存在一些不足，比如TCGA數據庫中為RNASeq數據，可能無法完全代表HDAC1蛋白表達水平以及研究數據部分分組樣本量較少可能造成統計學偏差，提示后續研究可通過Western blot和免疫組織化學技術從蛋白質表達水平驗證HDAC1分子機制與信號通路，為探明GC的發生發展和靶向治療提供新的思路。