家蠅三齡幼蟲(chóng)Mdctl基因原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析*

常振策，李忠旬，賈利娜，修江帆，國(guó)果,2，吳建偉,2***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

家蠅生活在病原物富集的環(huán)境中，卻鮮見(jiàn)感染造成的傷害，并且能夠正常地完成生命活動(dòng)，說(shuō)明它具有強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)[1-4]。近年來(lái)，家蠅的先天免疫日益成為研究熱點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲(chóng)后可刺激家蠅C型凝集素基因(C-type lectin gene ofMuscadomestica，Mdctl)表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為該基因的表達(dá)產(chǎn)物在家蠅抗C.albicans感染過(guò)程中起作用[5]，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)Mdctl基因的研究報(bào)道。為后續(xù)研究Mdctl基因在家蠅幼蟲(chóng)抗C.albicans感染過(guò)程中的作用，本課題研究構(gòu)建家蠅Mdctl基因原核表達(dá)體系，獲得了純化的Mdctl基因表達(dá)產(chǎn)物，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物、質(zhì)粒和菌株 家蠅3齡幼蟲(chóng)為本課題組飼養(yǎng)，克隆感受態(tài)E.coliDH5α和表達(dá)感受態(tài)E.coliBL21(DE3，北京全式金)，克隆載體pMD19-T購(gòu)自Takara公司，表達(dá)載體pET-28a(+)購(gòu)自Solarbio公司。

1.1.2主要試劑及儀器 Trizol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、原核表達(dá)相關(guān)試劑、氨芐青霉素購(gòu)自Takara，SDS-PAGE蛋白電泳相關(guān)試劑、卡那霉素、羊抗小鼠IgG-HRP、Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody、Western-Blot相關(guān)試劑及耗材購(gòu)自Solarbio，Ni-IDA Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自碧云天公司。核酸凝膠電泳裝置及成像系統(tǒng)、超聲破碎儀、電轉(zhuǎn)移裝置、蛋白凝膠電泳裝置均在貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室使用，Bio-Rad ChemiDoc MP和Nanodrop2000在貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研中心使用。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 運(yùn)用DNAMAN V6.0軟件分析Mdctl基因的開(kāi)放閱讀框、氨基酸序列和Mdctl蛋白信號(hào)肽位點(diǎn)，利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析Mdctl蛋白的理化性質(zhì)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析Mdctl蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.2pMD19-T/Mdctl克隆載體和pET28a(+)/Mdctl表達(dá)載體的構(gòu)建 按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取家蠅三齡幼蟲(chóng)總RNA，然后以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為Mdctl基因克隆時(shí)PCR擴(kuò)增的模板。基因組DNA的除去反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，然后冰浴5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 20 min，85 ℃ 10 s，4 ℃ 10 s。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)Mdctl基因的克隆引物(CkF、CkR)和Mdctl基因的表達(dá)引物(CbF、CbR)，由上海生工合成。Mdctl基因克隆上游引物(CkF)為ATGGGCGGTTACTTGGCCTC、游引物(CkR)為T(mén)CAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTCGGGC；Mdctl基因表達(dá)上游引物(CbF)為CTAGCTAGCGACTATTATCCAACTGACAGATGGTG，下游引物(CbR)為CCCAAGCTTTCAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTC。Mdctl基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠試劑盒純化回收，純化PCR產(chǎn)物和pMD19-T載體連接條件為16 ℃環(huán)境下作用12～16 h。將pMD19-T/Mdctl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α克隆感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。以測(cè)序成功的pMD19-T/Mdctl克隆質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增Mdctl基因。Mdctl基因和pET-28a(+)載體雙酶切反應(yīng)條件為37 ℃水浴酶切16～18 h,酶切產(chǎn)物用DNA凝膠試劑盒純化回收。酶切純化后Mdctl基因和pET-28a(+)載體連接條件為16 ℃環(huán)境下作用16～18 h。將pET28a(+)/Mdctl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定 將測(cè)序鑒定的pET-28a(+)/Mdctl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定正確的單菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)12 h后，以1 ∶50接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)至OD600值為0.6時(shí)，分別以不同濃度的IPTG、溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在離心重懸濃縮后的培養(yǎng)物中加入5×SDS上樣緩沖液，瞬時(shí)離心后煮沸10 min，15%的SDS-PAGE凝膠電泳分析Mdctl蛋白的表達(dá)，確定重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件。超聲破碎誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，分別取上清和沉淀進(jìn)行15%SDS-PAGE凝膠電泳。按照蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)，純化Mdctl重組蛋白，Western Blot鑒定Mdctl純化蛋白。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

Mdctl基因ORF長(zhǎng)為333 bp，編碼110個(gè)氨基酸(圖1)。Mdctl蛋白的信號(hào)肽為1～22位氨基酸，判定其為分泌型蛋白(圖2)。Mdctl蛋白理論分子量為13 131.42 Da，等電點(diǎn)約為4.49。Mdctl蛋白的Clect結(jié)構(gòu)域?yàn)?3～110位氨基酸，屬于C型凝集素超家族(圖3)。

注：圖中方框內(nèi)為信號(hào)肽序列。圖1 Mdctl基因的開(kāi)放閱讀框及氨基酸序列Fig.1 ORF of Mdctl and its amino acid sequence

圖2 Mdctl蛋白的信號(hào)肽分析Fig.2 Signal Peptide analysis of Mdctl protein

圖3 Mdctl蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of Mdctl protein

2.2 pMD19-T/Mdctl克隆載體和pET28a(+)/Mdctl表達(dá)載體的構(gòu)建

家蠅三齡幼蟲(chóng)總RNA電泳檢測(cè)可見(jiàn)，18 S條帶較28S條帶明亮清晰，28S條帶暗淡模糊，說(shuō)明提取的總RNA無(wú)顯著降解(圖4)。用Mdctl基因的克隆引物(CkF和CkR)對(duì)pMD19-T/Mdctl重組菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)顯示，其PCR產(chǎn)物在333 bp有一特異性條帶，與預(yù)期的片段大小相一致，經(jīng)測(cè)序鑒定表明Mdctl基因的克隆載體構(gòu)建成功(圖5)。用Mdctl基因的表達(dá)引物(CbF和CbR)對(duì)pET-28a(+)/Mdctl重組菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳顯示，其PCR產(chǎn)物條帶與理論值完全吻合，經(jīng)測(cè)序鑒定表明Mdctl基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖6)。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為家蠅三齡幼蟲(chóng)總RNA。圖4 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pMD19-T/Mdctl重組菌落PCR。圖5 pMD19-T/Mdctl重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pMD19-T/Mdctl

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pET-28a(+)/Mdctl重組菌落PCR。圖6 pET-28a(+)/Mdctl重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pET-28a(+)/Mdctl

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定

電泳結(jié)果顯示，在32 ℃，IPTG終濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)18 h時(shí)的蛋白表達(dá)量較高；Mdctl重組蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體表達(dá)，其分子量約為16 kDa，與Mdctl蛋白兩端融合6×His標(biāo)簽后的總分子量相一致(圖7)。以小鼠來(lái)源的抗His Tag單克隆抗體(1 ∶1 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(1 ∶4 000)為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定Mdctl純化蛋白，結(jié)果顯示，Mdctl純化蛋白與抗His Tag單克隆抗體特異性結(jié)合，出現(xiàn)一明顯免疫反應(yīng)條帶，分子量(約16 kDa)正確，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置未出現(xiàn)該條帶，進(jìn)一步確認(rèn)其為目的蛋白(圖8)。

注：M為14.4～97.4 kDa蛋白Marker，1為pet28a(+)空載未誘導(dǎo)，2為pet28a(+)空載誘導(dǎo)，3為Mdctl重組未誘導(dǎo)，4為Mdctl重組誘導(dǎo)，5為破碎后上清，6為破碎后沉淀，箭頭所示為16 kDa目的條帶。圖7 Mdctl重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.7 Induced expression of Mdctl recombinant protein

注：M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為Mdctl純化蛋白，2為Mdctl純化蛋白的His標(biāo)簽單抗檢測(cè)，3為陰性對(duì)照，箭頭所示為目的條帶。圖8 Mdctl純化蛋白的鑒定Fig.8 Identification of purified Mdctl protein

3 討論

家蠅具有極強(qiáng)的適應(yīng)周?chē)鷲毫迎h(huán)境的能力，這緣于它強(qiáng)大的先天免疫[1-4]。近年來(lái)，家蠅的先天免疫日益成為研究熱點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌感染家蠅幼蟲(chóng)后可刺激Mdctl基因表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為該基因的表達(dá)產(chǎn)物在家蠅抗C.albicans感染過(guò)程中起作用[5]。生物信息學(xué)分析顯示，Mdctl基因ORF全長(zhǎng)333 bp，編碼110個(gè)氨基酸，信號(hào)肽切割位點(diǎn)為22～23位氨基酸之間，是分泌型蛋白。Mdctl的氨基酸序列中存在Clect(C型凝集素結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)域，為23～110位氨基酸，而且還有特異性結(jié)合甘露糖的EPN/WND氨基酸基序，因此它屬于C型凝集素超家族，是一個(gè)新的家蠅C型凝集素。含有Ca2+依賴型的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)的為經(jīng)典C型凝集素，非Ca2+依賴型的C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的為非經(jīng)典C型凝集素[6]。C型凝集素在抗感染免疫中的主要功能有：作為一種調(diào)理素，參與免疫識(shí)別和對(duì)病原體的凝集吞噬作用；介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附、遷移和細(xì)胞之間的相互作用；參與止血、凝固、物質(zhì)運(yùn)輸及創(chuàng)傷修復(fù)等作用；引發(fā)凝集素補(bǔ)體途徑的激活等[6-8]。為后續(xù)研究Mdctl基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能，需要獲得足夠的Mdctl蛋白，但家蠅體內(nèi)的Mdctl蛋白含量少、分離提取困難、化學(xué)合成代價(jià)高，因此重組表達(dá)Mdctl蛋白是獲取Mdctl基因表達(dá)產(chǎn)物的最有效途徑。本研究通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)[9-13]，誘導(dǎo)表達(dá)家蠅Mdctl重組蛋白，分析得出，在32 ℃，IPTG終濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間18 h時(shí)，Mdctl重組蛋白表達(dá)量較高。Mdctl重組蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體表達(dá)。經(jīng)Western-Blot鑒定，Mdctl純化蛋白確實(shí)為目標(biāo)蛋白。

鑒于目前家蠅凝集素的分子鑒定[14-17]和家蠅體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能[18-24]報(bào)道甚少，Mdctl作為家蠅體內(nèi)一種新的凝集素基因，在白假絲酵母菌刺激家蠅三齡幼蟲(chóng)后高表達(dá)，本研究將進(jìn)一步開(kāi)展它對(duì)家蠅先天免疫調(diào)節(jié)作用的研究。