黃淮北片冬麥區抗赤霉病基因Fhb1種質挖掘及溯源

張穎君，高慧敏，李子千，胡夢蕓，孫麗靜，劉 茜，呂亮杰，李 輝

(1.河北省農林科學院 糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實驗室，河北 石家莊 050035； 2.河北省農林科學院 經濟作物研究所，河北 石家莊 050051)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，FHB)是由禾谷鐮刀菌引起的一種危害性很強的小麥真菌病害[1]。禾谷鐮刀菌在侵染小麥期間，特異誘導次生代謝基因簇fg3_54表達，合成一個非核糖體八肽-鐮孢菌素A(Fusaoctaxin A)，使菌絲可以從小麥組織內一個細胞穿壁入侵到相鄰的細胞，從而導致小麥感病[2]。由于禾谷鐮刀菌會產生真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，所以小麥赤霉病不僅影響小麥產量還嚴重影響小麥加工品質和食用安全性[3-4]。小麥赤霉病在我國長江中下游麥區發生比較嚴重，如江蘇省年均發生面積約120萬hm2，超過該省小麥種植面積的50%[5]。而近年來，受氣候變化、小麥-玉米輪作和秸稈還田等因素的影響，赤霉病在黃淮冬麥區有加重的趨勢[6]。河南省2012年小麥赤霉病發生面積為339.7萬hm2，2016年發生面積174.0萬hm2 [7]。在河北省中南部小麥赤霉病也有片狀發生。因此，提高赤霉病抗性已成為黃淮麥區特別是黃淮南片的主要育種目標之一[6]。黃淮麥區不具備赤霉病田間表型鑒定的理想環境，而人工鑒定多采用單花滴注或田間噴霧接種的方法，費時費力。利用分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)手段進行小麥抗赤霉病種質篩選是培育抗病品種的有效途徑。

目前,已定位到的小麥抗赤霉病QTL位點超過100個，以位于小麥3BS染色體的Fhb1基因抗性最強[1，8]。Fhb1基因最初發現于蘇麥3和其衍生品種寧7840[9-10]，表現為抗病原菌擴展，可降低赤霉病嚴重度20%左右[11]。多年來人們一直在尋求開發可用于Fhb1基因鑒定的分子標記。Anderson等[12]將Fhb1基因定位到小麥3BS染色體Xgwm533～Xgwm493區間，Cuthbert等[13]和Liu等[14]將其精細定位到標記sts3B-189～sts3B-206之間，遺傳距離1.2 cM。Liu等[15]將Fhb1基因縮小到261 kb的區間，開發了共顯性標記UMN10。Bernardo等[16]分析了Fhb1基因附近的EST(Expressed sequence tags)序列，在標記Xgwm533～Xgwm493區間發現7個SNP與小麥赤霉病抗性相關，其中Xsnp3BS-8存在于蘇麥3號及其衍生品種中。Rasheed等[17]根據Xsnp3BS-8位點開發了KASP(Kompetitive allele specific PCR)標記用于小麥種質材料Fhb1基因檢測。Rawat等[18]克隆了PFT(Pore-forming toxin-like)基因，認為PFT可能是Fhb1基因，PFT有3種基因型：PFT-Ⅰ(蘇麥3號類型)、PFT-Ⅱ(南大2419類型)和PFT-Ⅲ(基因缺失類型)[6]。這些標記在小麥抗赤霉病育種過程中起到了一定的作用，但不能將Fhb1等位基因有效區分。Su等[19]和朱展望等[6]分析了PFT鄰近的His(Histidine-rich calcium-binding protein)基因序列，發現在蘇麥3號類型品種中His基因在5′-UTR區(Untranslated region)和部分ORF區(Open reading frame)存在序列缺失。His基因有3種等位基因類型，分別為His-Ⅰ(蘇麥3號類型，1 309 bp)、His-Ⅱ(2 061 bp)和His-Ⅲ(2 061 bp)。其中His-Ⅰ起始密碼子附近有752 bp缺失，His-Ⅲ與His-Ⅱ長度相同但存在4個SNP變異。根據此InDel區段Su等[19]開發了共顯性標記TaHRC-GSM和KASP標記TaHRC-Kasp，朱展望等[6]開發了共顯性標記His-InDel，這些標記可以較有效的區分小麥赤霉病抗/感種質。本研究對336份小麥主栽品種和種質材料利用KASP標記TaHRC-Kasp進行檢測，然后利用His基因的共顯性標記His-InDel進行進一步驗證，以期篩選出含有Fhb1基因的種質材料，為黃淮冬麥區抗赤霉病小麥育種提供寶貴的遺傳信息及親本材料。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究共選擇336份小麥主栽品種和種質作為試驗材料，其中黃淮冬麥區312份(包括河北136份、河南89份、山東72份、陜西15份)。由于江蘇、安徽兩省是小麥赤霉病的重發區，所以選擇了24份材料(江蘇17份、安徽7份)一并進行Fhb1基因檢測。

1.2 KASP標記檢測

根據Su等[19]開發的Fhb1基因的KASP標記，在抗赤霉病基因型(Fhb1+)引物添加FAM熒光，在感赤霉病基因型(Fhb1-)引物添加HEX熒光。Fhb1+引物序列為5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGGGCTCACGTCGTGCAAATGGT-3′，Fhb1-引物序列為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTCTGTTTCGCTGGGATG-3′，反向通用引物序列為5′-CTTCCAGTTTCTGCTGCCAT-3′。利用此KASP標記對336份小麥材料進行檢測，采用384孔PCR板，3 μL反應體系(包括DNA模板60～100 ng，2×KASP master mixture 2 μL，引物混合液0.056 μL)，PCR擴增程序為94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，65～57 ℃(每循環降溫1 ℃)退火1 min，10個循環；94 ℃變性20 s，57 ℃退火1 min，35個循環。KASP檢測采用LGC公司(http://www.lgcgenomics.com)SNP分型檢測系統完成。

1.3 His-InDel標記驗證及His基因序列分析

采用朱展望等[6]開發的His-InDel標記對KASP檢測的部分材料進行驗證，His-InDel標記正向引物序列為5′-ATGCGTGCGCTGTACTTG-3′，反向引物序列為5′-CGTCACAGAGTCCAGTGAAA-3′。PCR反應體系：2×PCR Mix 10 μL，DNA模板約100 ng，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR Mix購于康為世紀有限公司(http：//www.cwbiotech.com/)，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司(http：//invitrogen.tecenet.com)合成。PCR擴增在BioRad公司(http：//www.bio-rad.com)MyCycler PCR儀上進行，擴增程序為95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共35個循環；最后72 ℃ 延伸7 min，10 ℃保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)浸泡染色后在BioRad公司凝膠成像系統下照相，記錄電泳結果。目標條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，http：//www.tiangen.com)進行回收，操作步驟參見試劑盒說明書。T-載體采用北京全式金生物技術有限公司(http：//www.transgen.com.cn)Easy-T3載體，連接體系為T-載體1 μL，回收產物4.0 μL，室溫連接20 min。連接后的載體利用熱激法轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α(北京全式金生物技術有限公司)，轉化后的大腸桿菌DH5α涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養基(酵母提取物5 g、胰蛋白凍10 g、NaCl 10 g、瓊脂粉6 g、加蒸餾水至1 L)上，并進行藍白斑篩選。每個LB平板挑取6個陽性克隆進行測序，序列測定由深圳華大科技公司(http：//www.bgitechsolutions.cn)完成，序列分析采用軟件DNAMAN(http：//www.lynnon.com)和Vector NTI Advance 10(http：//www.invitrogen.com)進行。

1.4 PCA分析

對供試的336份材料采用小麥15K芯片(中玉金標記生物技術股份有限公司，http：//www.cgmb.com.cn)進行SNP位點檢測。利用R語言編寫程序對SNP數據進行質控(Quality control)，去除數據缺失(Missing data)>0.5、雜合率>0.1和最小基因頻率(Minmum allele frequency，MAF)>0.05的數據。利用Tassel 5.0 軟件進行PCA(Principal component analysis)分析。

2 結果與分析

2.1 Fhb1基因KASP標記檢測結果

利用Fhb1基因KASP標記對供試的336份小麥材料進行檢測，有2個河北材料(石家莊75、紫莖白)與3個來自江蘇的抗赤霉病材料(蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13)攜帶FAM熒光，聚集在y軸附近，表現為抗赤霉病類型(Fhb1+)；有3個材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)表現為雜合基因型(Fhb1+/-)；其余材料攜帶HEX熒光信號，聚集在x軸附近，為感赤霉病類型(Fhb1-)(圖1)。

圖1 Fhb1基因KASP標記檢測結果Fig.1 Fhb1 genotyping analysis using KASP Marker

2.2 His-InDel標記檢測結果

為了驗證KASP標記的準確性，采用朱展望等[6]開發的His-InDel標記對其進行進一步檢測。檢測品種包括5個KASP標記檢測顯示抗赤霉病類型的材料(石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13)、3個雜合基因型材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)和16個感赤霉病類型材料(鄭麥9023、小偃22等)。從圖2可以看出，His-InDel為共顯性標記，可以將材料進行明顯區分。石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13和寧豐518擴增得到1 309 bp條帶，表現為His-Ⅰ基因型(抗赤霉病類型)；鄭麥9023、西農979、小偃22等17個材料擴增得到2 061 bp條帶，為His-Ⅱ(感赤霉病類型)；寧麥16表現為Fhb1雜合類型。KASP標記與His-InDel標記檢測結果基本一致，但寧豐518品種KASP檢測為Fhb1-基因型，而His-InDel標記檢測為Fhb1+基因型；德宏福6號和泊麥7號2份材料KASP檢測為雜合類型，而His-InDel標記檢測為Fhb1-基因型。

2.3 His基因序列分析結果

對蘇麥3號、石家莊75和紫莖白3個品種的His-InDel標記PCR擴增條帶進行回收、測序，分析其His基因序列。結果顯示，石家莊75、紫莖白與蘇麥3號的His基因序列一致，為1 309 bp，表現為Fhb1+基因型(圖3)。測序結果進一步驗證了His-InDel標記檢測的準確性。

1.鄭麥9023；2.西農979；3.小偃22；4.鄭麥366；5.冀5265；6.冀麥325；7.濟麥22；8.矮抗58；9.農大5363；10.輪選103；11.德宏福6號；12.泊麥7號；13.周麥35；14.豫教黑1號；15.晉麥8號；16.寧麥13；17.寧麥16；18.皖981；19.皖農306；20.寧豐518；21.石家莊75；22.紫莖白；23.蘇麥3號；24.寧麥9號；M.Marker Ⅲ。

1.Zhengmai 9023；2.Xinong 979；3.Xiaoyan 22；4.Zhengmai 366；5.Ji 5265；6.Jimai 325；7.Jimai 22；8.Aikang 58；9.Nongda 5363；10.Lunxuan 103；11.Dehongfu 6；12.Bomai 7；13.Zhoumai 35；14.Yujiaohei 1；15.Jinmai 8；16.Ningmai 13；17.Ningmai 16；18.Wan 981；19.Wannong 306；20.Ningfeng 518；21.Shijiazhuang 75；22.Zijingbai；23.Sumai 3；24.Ningmai 9；M.Marker Ⅲ.

圖2 His-InDel標記PCR檢測結果
Fig.2 PCR results of His-InDel Marker

圖3 不同品種His基因序列比對分析Fig.3 Alignment of His gene sequences of different cultivars

2.4 基于全基因組SNP位點分析供試小麥材料的親緣關系

利用小麥15K芯片對336份材料進行檢測，共獲得SNP位點13 947個。通過數據質控，去除4 168個位點，最終獲得9 779個SNP位點用于供試材料的PCA分析。從PCA結果(圖4)可以看出，336份小麥材料主要分為3個群，分別為河北(紅色菱形)、河南(綠色三角)和山東(藍色圓圈)。來自陜西(橙色圓圈)的材料多數與來自河南的材料聚在一起，來自江蘇(紫色方塊)和安徽(黃色菱形)的材料多數聚在坐標軸中心附近。來自河北的攜帶Fhb1基因的2個材料石家莊75和紫莖白位于坐標軸中心附近，這2個材料與來自江蘇的材料親緣關系較近。

圖4 336份小麥材料PCA分析結果Fig.4 PCA analysis of 336 wheat samples

3 結論與討論

小麥赤霉病田間表型鑒定受天氣和接種方法等多種因素影響，穩定性和重復性差，經常需要進行多年多地點鑒定才能提高鑒定的準確性[20]，而黃淮麥區因缺少適合田間表型鑒定的氣候條件，所以赤霉病抗性品種的篩選難度更大。因此，利用分子標記輔助選擇(MAS)可以大大提高赤霉病抗性品種的培育速度。Fhb1是目前為止報道的效應最大的赤霉病抗性基因，前人一直致力于Fhb1基因的克隆和標記開發以服務于小麥抗赤霉病育種[6，12-19]。本研究利用Su等[19]開發的Fhb1基因的KASP標記TaHRC-Kasp對來自黃淮冬麥區(河北、河南、山東、陜西)和江蘇、安徽的共336份小麥材料進行檢測，共檢測出5份攜帶Fhb1基因的品種，其中有2份是來自河北省的品種石家莊75和紫莖白，其余3份為來自江蘇省的蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13，這3份材料是公認的攜帶Fhb1基因的品種。有3份材料(寧麥16、德宏福6號和泊麥7號)表現為Fhb1雜合基因型，其余材料為Fhb1-基因型。為了驗證KASP標記檢測結果，本研究挑選了24份材料利用朱展望等[6]開發的His-InDel標記做進一步檢測。His-InDel標記與KASP標記檢測結果基本一致，但寧豐518品種KASP檢測為Fhb1-基因型，而His-InDel標記檢測為Fhb1+基因型；德宏福6號和泊麥7號2份材料KASP檢測為雜合類型，而His-InDel標記檢測為Fhb1-基因型，這可能是受KASP標記檢測的特異性或熒光信號的偏差所影響。KASP標記由于檢測速度快、通量高，已廣泛應用于作物分子標記輔助育種。從本研究結果看，TaHRC-Kasp標記基因分型清晰，檢測準確性也較高，將TaHRC-Kasp標記和His-InDel標記結合使用可以大大提高小麥抗赤霉病育種效率。

Fhb1基因在我國江蘇、安徽等赤霉病重發區已得到廣泛應用，并且在北美和日本應用也較為廣泛[18，20-21]。研究表明，中國小麥品種所含Fhb1基因主要有2個來源，分別為蘇麥3號和寧麥9號，利用蘇麥3號在長江中下游麥區育成了寧7840等品種，利用寧麥9號培育成了寧麥系列品種(如寧麥13、寧麥14、寧麥26等)和揚麥系列品種(如揚麥18、揚麥21等)[6]。隨著近年來黃淮麥區赤霉病呈加重趨勢，提高小麥赤霉病抗性已成為黃淮南片麥區主要育種目標之一，但Fhb1基因在黃淮麥區的應用相對緩慢，目前尚無攜帶Fhb1基因的小麥品種報道。究其原因一則可能與黃淮麥區抗赤霉病育種時間較短有關，二則可能是由于Fhb1基因與某些不利農藝性狀連鎖較緊密[6]，導致在育種進程中Fhb1基因受到人工選擇壓力而被去除。有研究表明，Fhb1+基因型與稈銹病基因Sr2-基因型緊密連鎖[22]，在很大程度上限制了Fhb1基因的應用，本研究也發現6個Fhb1+基因型品種(石家莊75、紫莖白、蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13和寧豐518)不攜帶Sr2抗性基因。由于光溫等氣候條件的差異，長江中下游春麥區的抗赤霉病小麥品種很難在黃淮冬麥區直接應用，因此，在黃淮冬麥區篩選攜帶Fhb1基因的種質材料對黃淮冬麥區抗赤霉病小麥育種尤為重要。本研究利用TaHRC-Kasp和His-InDel標記篩選出2個來自河北省的材料(石家莊75和紫莖白)攜帶Fhb1基因。His基因序列分析也顯示石家莊75、紫莖白和蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13、寧豐518的序列一致，為抗赤霉病類型；鄭麥9023、小偃22、矮抗58、泊麥7號等為感赤霉病類型。小麥品種石家莊75的親本組合為“矮立多/碧玉麥//安徽5號”，矮立多(Ardito)是從意大利引進的品種，碧玉麥(Quality)是20世紀40年代初從美國引進的春麥材料，矮立多和碧玉麥不具有Fhb1基因。安徽5號的親本為南大2419和勝利麥。南大2419是從1932年引入的意大利品種Mentana中混選出來的，勝利麥是建國初期的農家品種。南大2419是Fhb1-材料，所以，石家莊75中的Fhb1基因有可能是來源于勝利麥，但這還需進行進一步驗證核實。紫莖白是河北省的地方農家種，其攜帶Fhb1基因，這說明最初Fhb1基因在國內一些地方品種中有所分布(如望水白、白三月黃、黃方柱、火燒麥、火燒白日麥和菜籽黃等)[23-26]，但在現代育種進程中受到人工選擇的壓力而逐漸消失。

經TaHRC-Kasp和His-InDel標記檢測和His基因序列分析，證明來自河北省的2份小麥材料石家莊75和紫莖白攜帶Fhb1基因。TaHRC-Kasp和His-InDel標記聯合使用進行分子標記輔助選擇可以大大提高抗赤霉病小麥育種效率。

致謝：感謝中國農業科學院作物科學研究所何中虎研究員、夏先春研究員在Fhb1基因KASP標記檢測過程中提供的幫助，感謝湖北省農業科學院糧食作物研究所朱展望博士提供His-InDel標記信息。