雷波野生茶樹資源春季新梢主要生化成分分析

周 斌，王留彬，韓浩蕾，徐新濤，唐 茜，譚禮強

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，成都 611130；2.雷波縣玉竹春茶廠，四川雷波 616561)

中國是茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]原產(chǎn)地[1]，在西南和華南地區(qū)都有較多的野生茶樹分布，包括橫斷山脈分布區(qū)、滇桂黔分布區(qū)、滇川黔分布區(qū)、南嶺山脈分布區(qū)等[2]。川渝地區(qū)的野生茶樹主要分布在長江、金沙江兩岸，包括雷波、宜賓、瀘州、合江等地區(qū)，及四川盆地的西部邊緣，包括崇州、滎經(jīng)、邛崍、大邑等市縣[3]。經(jīng)過長期的自然選擇，野生茶樹資源中可能蘊含著大量抗逆基因和獨特的品質(zhì)相關基因，因此對于茶樹遺傳演化、資源保存、分子育種研究有重要意義，部分野生茶樹還可直接用于茶葉加工，具有較大的商業(yè)開發(fā)價值。

茶樹鮮葉內(nèi)的生化成分是形成茶葉色、香、味、形的物質(zhì)基礎，生化成分質(zhì)量分數(shù)與組成的差異直接影響成茶的品質(zhì)、風味和適制性。不同的茶樹資源，由于生長環(huán)境及自身遺傳代謝的差異，生化成分質(zhì)量分數(shù)和組成有顯著不同[4]，因此開展生化成分質(zhì)量分數(shù)分析和評價是茶樹種質(zhì)資源發(fā)掘和利用的前提。通過對野生茶樹資源進行調(diào)查、觀測和生化成分測定，有助于了解該資源的遺傳多樣性，比較資源間生化成分的差異，還可以發(fā)掘特異單株等。

已有學者對貴州[5-6]、云南[7]、四川[8-9]、廣西[10]等地部分野生茶樹的品質(zhì)成分做了相關的研究分析，但目前關于四川雷波野生茶樹資源的生化成分研究還尚未見報道。雷波縣位于四川涼山州地區(qū)，毗鄰云南，是野生茶樹集中分布地之一，根據(jù)課題組的前期考察，在雷波縣羅沙溪鄉(xiāng)銀廠溝村(28°30′10″N，103°29′5″E，海拔1 200～ 1 300 m)附近數(shù)座山上有約133.33 hm2的野生茶樹集中分布區(qū)，以大葉種、小喬木型野生茶樹為主，也有少量小葉種、灌木型野生茶樹，其中部分茶樹高近10 m，主干直徑在20 cm以上的有近百株(圖1)。本試驗從中選取50份資源為研究對象，采其春季一芽二葉制成生化樣并測定了其主要品質(zhì)成分，以探究雷波野生茶樹資源生化成分質(zhì)量分數(shù)特點及多樣性水平,發(fā)掘育種材料,推動其保護和利用工作。

圖1 雷波縣代表性野生茶樹的形態(tài)照片F(xiàn)ig.1 Morphological features of representative wild tea trees in Leibo county

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了取樣具有代表性，根據(jù)不同區(qū)域(山澗)將雷波縣銀廠溝村約133.33 hm2野生茶樹集中分布區(qū)劃分為4個區(qū)塊。2019年3月下旬，從每個區(qū)塊隨機選取11～16株野生茶樹并編號，共計50株(編號的首位數(shù)字代表采樣區(qū)塊號)，采集各株春季頭輪一芽二葉新梢。

1.2 樣品制備與試驗方法

生化樣的制備依據(jù)《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[11]中的方法進行，即：一芽二葉鮮葉經(jīng)微波殺青后轉(zhuǎn)至80 ℃恒溫干燥箱烘干固樣，將烘干茶樣帶回實驗室用高速磨樣機粉碎，待用。

茶葉含水量的測定采用GB/T 8304—2013中的120 ℃快速烘干法；茶多酚質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB/T 8313—2018中的福林酚比色法；游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB/T 8314—2013中的茚三酮比色法；咖啡堿質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB/T 8312—2013中的紫外分光光度法；水浸出物質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB/T 8305—2013進行測定；兒茶素總量的測定采用香莢蘭素比色法[12]。

1.3 統(tǒng)計分析

每份資源各成分質(zhì)量分數(shù)均測量3次，采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，進行基本統(tǒng)計分析和聚類分析。變異系數(shù)為標準差與平均數(shù)的比值，記為CV。采用Shannon-Wiener指數(shù)(H′)[13]計算多樣性指數(shù)，公式為：

H′=-∑ni=1PiLn(Pi)

式中，Pi為某性狀第i種個體數(shù)占總個體的比例，n為個體總數(shù)。計算前先對數(shù)據(jù)進行標準化處理，進行10級分類，1級

2 結果與分析

2.1 生化成分結果

雷波野生茶樹資源的主要生化成分結果及基本特征數(shù)據(jù)見表1和表2。50份資源游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)為1.64%～4.29%(占干物質(zhì)量比例，下同)，平均2.58%；咖啡堿質(zhì)量分數(shù)為3.75%～ 5.30%，平均4.62%；茶多酚質(zhì)量分數(shù)為 13.97%～20.82%，平均16.99%；兒茶素質(zhì)量分數(shù)為8.76%～16.12%，平均12.06%；水浸出物質(zhì)量分數(shù)為35.10%～48.60%，平均41.39%；酚氨比為3.41～12.67，平均為7.00。

由表2可知，50份資源的氨基酸、咖啡堿、茶多酚、兒茶素、水浸出物及酚氨比的變異系數(shù)(CV)分別為23.63%、 8.55%、9.50%、14.12%、7.54%、28.58%；多樣性指數(shù)(H′)分別為1.94、2.03、2.00、2.03、2.01、1.98，均值為2.00。

2.2 基于生化成分的聚類分析

以氨基酸、茶多酚、咖啡堿、兒茶素和水浸出物為變量，采用離差平方和法(Ward’s method)，距離為歐氏距離，對50份野生茶樹資源進行聚類分析，結果如圖2所示。50份資源可劃分為4個類群，各個類群之間生化成分質(zhì)量分數(shù)存在差異(表3)。第1類群數(shù)量最多，由15份資源組成，該類群茶多酚、兒茶素及水浸出物質(zhì)量分數(shù)都最高，酚氨比最大，但氨基酸質(zhì)量分數(shù)最低。第4類群與之相反，該類群包含11份資源，其氨基酸質(zhì)量分數(shù)最高，但茶多酚、兒茶素及水浸出物質(zhì)量分數(shù)最低，酚氨比最小。第2，3類群分別由10、14份資源組成，第2類群咖啡堿質(zhì)量分數(shù)最低，第3類群咖啡堿質(zhì)量分數(shù)最高，這兩類群其余各生化成分質(zhì)量分數(shù)適中。

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準差”。

Note:The data are “average ± standard deviation”.

表2 主要生化成分質(zhì)量分數(shù)的基本統(tǒng)計參數(shù)Table 2 Basic statistical parameters of mass fraction of main biochemical components

圖2 雷波50份野生茶樹資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 50 accessions of wild tea tree germplasms resoruces in Leibo

表3 不同類群資源主要生化成分質(zhì)量分數(shù)平均值Table 3 Average mass fraction of major biochemical components in different groups of resources

2.3 特異、優(yōu)良種質(zhì)資源初步篩選

按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評價規(guī)范-茶樹(NY/T 2031-2011)》[14]對50份資源進行篩選評價。特異種質(zhì)資源(rare germplasm)是指性狀表現(xiàn)特殊的、稀有的種質(zhì)資源。優(yōu)良種質(zhì)資源(elite germplasm)表示主要經(jīng)濟性狀表現(xiàn)好且具有重要價值的種質(zhì)資源。依據(jù)特異種質(zhì)資源的主要生化指標：氨基酸質(zhì)量分數(shù)≥5.0%，高茶多酚質(zhì)量分數(shù)≥25.0%，低茶多酚質(zhì)量分數(shù)≤7.5%，兒茶素質(zhì)量分數(shù)≥20.0%，高咖啡堿質(zhì)量分數(shù)≥5.0%，低咖啡堿質(zhì)量分數(shù)≤1.5%；優(yōu)良種質(zhì)資源的主要生化指標：氨基酸質(zhì)量分 數(shù)≥4.0%，茶多酚質(zhì)量分數(shù)≥20.0%，對50份野生茶樹資源進行初步篩選，由表4可知，初步篩選出特異資源9份，潛在優(yōu)良資源4份，高水浸出物資源5份。

表4 基于生化成分的資源篩選Table 4 Resource screening based on biochemical components

3 結論與討論

3.1 雷波野生茶樹資源生化成分特征分析

Chen等[15]對中國596份茶樹種質(zhì)資源的研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸質(zhì)量分數(shù)平均為3.3%，茶多酚質(zhì)量分數(shù)平均為28.4%，咖啡堿質(zhì)量分數(shù)平均為 4.2%。在本研究中，雷波野生茶樹群體氨基酸質(zhì)量分數(shù)平均為2.58%，茶多酚質(zhì)量分數(shù)平均為 16.99%，咖啡堿質(zhì)量分數(shù)平均為4.62%，氨基酸和茶多酚質(zhì)量分數(shù)低于中國栽培種茶樹的平均質(zhì)量分數(shù)。研究證實，野生茶樹的氨基酸質(zhì)量分數(shù)和茶多酚質(zhì)量分數(shù)相較于栽培茶樹存在偏低的現(xiàn)象[2]，這是由于栽培條件的差異及多年的育種選擇造成的。氨基酸質(zhì)量分數(shù)和其他野生茶樹群體資源相比，高于貴州(2.21%)[13]，云南(2.31%～2.48%)[7,16]野生茶樹氨基酸質(zhì)量分數(shù)，但低于廣西大瑤山(3.60%)[17]、金秀(3.47%)[18]野生茶樹氨基酸質(zhì)量分數(shù)，說明雷波野生茶樹的氨基酸質(zhì)量分數(shù)在野生茶樹群體中處于中等的水平。

值得注意的是，雷波野生茶樹資源咖啡堿質(zhì)量分數(shù)高于栽培種茶樹的咖啡堿質(zhì)量分數(shù)。雷波野生茶樹咖啡堿質(zhì)量分數(shù)遠高于貴州[5,13,19-20](2.74%～3.74%)、云南[7,16](3.83%～4.14%)、廣東[21](3.27%)和廣西(3.89%)[22]境內(nèi)野生茶樹咖啡堿平均質(zhì)量分數(shù)，并且大部分(76%)資源咖啡堿質(zhì)量分數(shù)為4.00%～5.00%，質(zhì)量分數(shù)≥5.0%的特異資源有9份，占資源總數(shù)的18%，說明該野生茶樹群體資源整體咖啡堿質(zhì)量分數(shù)較高，具有較大選育出高咖啡堿資源的潛力。雷波野生茶樹資源兒茶素質(zhì)量分數(shù)較低僅為 12.06%，低于中國茶樹種質(zhì)資源的平均質(zhì)量分數(shù) (15.45%)[23]，張凱等[24]對川渝地區(qū)野生大茶樹兒茶素質(zhì)量分數(shù)的研究也證實四川的野生大茶樹兒茶素質(zhì)量分數(shù)總體較低。

3.2 雷波野生茶樹資源生化成分多樣性分析

雷波野生茶樹資源基于生化成分的變異系數(shù)(CV)變化范圍為7.54%～28.58%，平均值為15.32%，其中變異系數(shù)(CV)最大的為酚氨比(28.58%)，其次為氨基酸(23.63%)。遺傳多樣性指數(shù)(H′)為1.94～2.03，平均值為2.00，高于廣西98份茶樹資源的遺傳多樣性指數(shù) (1.90)[10]，與貴州53份野生古茶樹資源 (2.00)[13]，陜西88份茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性指數(shù) (2.01)[25]相當。結果表明，雷波野生茶樹資源的主要生化成分在不同材料間有明顯的差異，變異系數(shù)較大，多樣性指數(shù)高，表現(xiàn)出豐富的多樣性。

通過聚類分析，50份資源可以分為4個類群，各個類群都包含有不同片區(qū)的茶樹，聚類時并未因采樣區(qū)塊的不同而有差異，可能是因為各區(qū)塊地理距離相近，區(qū)域種群間的基因交流沒有受到地理隔離的限制，未對茶樹分化造成明顯影響，并且4個片區(qū)的海拔與土壤營養(yǎng)狀況相似，茶樹生化成分沒有較大差異。

3.3 雷波野生茶樹資源的篩選與保護利用

對野生茶樹開展資源鑒定與評價是獲得特異種質(zhì)資源的基本途徑[26]。本研究基于主要生化成分的差異，可以從50份雷波野生茶樹資源中初步篩選出咖啡堿質(zhì)量分數(shù)≥5.0%的特異資源9份，氨基酸質(zhì)量分數(shù)≥4.0%、茶多酚質(zhì)量分數(shù)≥20.0%的優(yōu)良資源3份、1份，高水浸出物(水浸出物質(zhì)量分數(shù)≥45.0%)資源5份。另外，還發(fā)現(xiàn)LB108、LB208、LB114資源兼具多種優(yōu)良特性，具有較高的育種價值，例如資源LB114其茶多酚、兒茶素、水浸出物質(zhì)量分數(shù)在50份資源中均為最高，資源LB208咖啡堿和氨基酸質(zhì)量分數(shù)均較高。

野生茶樹作為重要的育種材料，具有許多目前開發(fā)利用上所急需的優(yōu)異性狀如高咖啡堿、高氨基酸、高抗性等，可以作為茶樹雜交育種，分子輔助育種等育種方式的新材料進行突破性育種，也可以直接篩選優(yōu)良單株，進行扦插繁育加以利用[2]。本試驗對雷波野生茶樹種質(zhì)資源主要生化成分進行了鑒定和評價，結果表明其生化成分存在較高的遺傳多樣性，并且篩選出15株優(yōu)良單株，以上研究結果可以為今后茶樹育種提供新的材料或直接利用奠定基礎。該群體資源咖啡堿質(zhì)量分數(shù)較高，也可直接作為工業(yè)提取天然咖啡堿的原料。

目前，雷波地區(qū)野生茶樹的管理和保護措施還較為薄弱，存在過度采摘、砍伐的現(xiàn)象，少部分茶樹受到病蟲草害的較大影響，造成了部分珍稀資源的流失，因此野生茶樹資源的保護工作需進一步加強，可通過建立核心保護區(qū)、制定野生茶樹的管理辦法和技術方案、向民眾普及野生茶樹資源保護的重要性等措施實現(xiàn)珍稀資源的保護和 利用。