二代測序在1例肝膿腫合并血流感染患者病原體檢測中的應(yīng)用

黃 宇， 張志華， 郝長來

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 河北 承德 067000)

1 臨床資料

患者男，59歲，因“發(fā)熱6d”于2019年4月8日入院。患者6d前出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高40℃，伴畏寒、寒戰(zhàn)，伴惡心、嘔吐，無腹痛、腹瀉。既往2型糖尿病病史。查體：T 36.8℃，P 120次/分，R 28次/分，BP 170/106mmHg，神志清楚，皮膚、鞏膜無黃染，雙肺呼吸音清，未聞及干濕性啰音，心律齊，腹軟，無壓痛，肝脾未觸及，肝區(qū)叩擊痛。急診實驗室檢查：血常規(guī)：白細胞計數(shù)(WBC)31.13×109L-1，血紅蛋白145g/L，血小板計數(shù)(PLT)8×109L-1，中性粒細胞比率(NEUT)測不出，中性晚幼粒細胞6%，中性桿狀核粒細胞13%，中性分葉核粒細胞79%，單核細胞2%；C-反應(yīng)蛋白(CRP)157.19mg/L；降鈣素原(PCT)>100ng/mL(表1)；肝功能：總膽紅素37.81umoL/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶104.00U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶96.82U/L；血糖24.67mmoL/L。腹部CT提示肝實質(zhì)密度減低，肝右葉點片狀氣體密度灶(圖2A)。以“血小板減少癥”轉(zhuǎn)入血液科。

當(dāng)日下午患者出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)及休克，給予美羅培南1g 每8小時1次聯(lián)合替硝唑0.8g 每12小時1次抗感染及降糖、補液等治療，并在B超定位下行經(jīng)皮肝膿腫穿刺置管引流術(shù)(圖1)，送檢膿液和血液行微生物培養(yǎng)，同時送血樣進行NGS檢測(細菌、真菌、病毒、支原體/衣原體、寄生蟲、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群)。分別于入院第3天、第4天膿液及血液培養(yǎng)回報：產(chǎn)酸克雷伯菌，藥物敏感實驗均提示美羅培南、頭孢孟多、頭孢哌酮舒巴坦鈉等常用抗感染藥物敏感。NGS回報為肺炎克雷伯菌和變棲克雷伯菌(表2)。入院第5天以“肝膿腫”轉(zhuǎn)入普外科，停用美羅培南，換用頭孢孟多酯鈉2g每8小時1次抗感染治療。

表1 實驗室指標(biāo)變化

*：測不出 -：無

表2 血液NGS結(jié)果

入院第3天、第4天送檢的血培養(yǎng)回報陰性，NGS仍檢測到大量克雷伯菌屬，但序列數(shù)較前下降。入院第8天患者仍有發(fā)熱，體溫最高38.8℃，復(fù)查血常規(guī)：WBC 13.28×109L-1，PLT 304×109L-1， NEUT 83.0%；CRP 81.25mg/L；PCT 1.27ng/ml。再次送檢血培養(yǎng)結(jié)果陰性，NGS檢測到克雷伯菌屬序列數(shù)較前無明顯減少，故停用頭孢孟多酯鈉，換用頭孢哌酮舒巴坦鈉3g每12小時1次抗感染治療。

入院第11天，患者病情有所改善，復(fù)查血常規(guī)：WBC12.94×109L-1，PLT300×109L-1，NEUT 88.9%；CRP 115.18mg/L；PCT 1.13ng/ml。繼續(xù)送檢血培養(yǎng)回報陰性，NGS檢測到克雷伯菌屬序列數(shù)較前下降。入院第15天，患者發(fā)熱頻率及熱峰較前下降，膿液引流量逐漸減少，復(fù)查腹部CT提示病變范圍較前縮小(圖2B)。血常規(guī)：WBC 7.49×109L-1，PLT 329×109L-1，NEUT 77.2%；CRP 92.86mg/L；PCT 0.72ng/ml。入院第18天，患者體溫降至正常，復(fù)查血常規(guī)：WBC 5.21×109L-1，PLT 290×109L-1，NEUT 55.90%；PCT 0.02ng/ml，血培養(yǎng)陰性， NGS檢測到少量克雷伯菌屬。此后患者未再發(fā)熱。入院第22天，患者好轉(zhuǎn)出院。

圖1 超聲定位下經(jīng)皮肝膿腫穿刺圖像

右肝后葉可見范圍約64.6mm×55.3mm×65.3mm強回聲，由多發(fā)氣體強回聲組成，后方伴聲影，邊界尚清楚，形態(tài)不規(guī)整。

圖2 治療前后肝膿腫CT圖像

圖2 A肝實質(zhì)密度減低，肝右葉點片狀氣體密度灶 ；圖2B肝膿腫治療后改變

2 討 論

細菌性肝膿腫是肝實質(zhì)的液化性壞死，常見致病菌為肺炎克雷伯菌[1]。肝膿腫主要表現(xiàn)是發(fā)熱、腹痛、寒戰(zhàn)，而右上腹壓痛、肝區(qū)叩擊痛、肝腫大等體征發(fā)生率較低，提示疾病部位的癥狀體征少，缺乏特異性，增加了臨床診斷的難度。如果診斷治療不及時， 病死率較高， 導(dǎo)致死亡主要原因是血流感染或感染性休克。早期診斷不僅需要詳細的病史及針對性的檢查，還需動態(tài)觀察患者病情，必要時可行細菌培養(yǎng)或穿刺病檢明確。早期排膿及使用抗菌藥物可減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低病死率，經(jīng)皮穿刺置管引流術(shù)是臨床治療的首選[2]。

NGS是一種新興的病原體檢測技術(shù)，具有精準(zhǔn)、快速、靈敏度高、可定量分析的優(yōu)點[3]。近年來NGS被廣泛用于多種感染性疾病的診斷，均表現(xiàn)出良好的診斷性能[4]。目前，二代測序在感染性疾病方面的研究仍集中于病原體鑒定，在感染性疾病診斷中，其準(zhǔn)確、非選擇性的特點較好地補充了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法的不足，有一定的臨床應(yīng)用價值。然而，在病原體序列數(shù)與病情變化的相關(guān)性方面的研究較少，其定量分析優(yōu)勢尚未發(fā)揮。Ai等人報道了4例具有類似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀的病例，其中NGS既用于未知病因診斷，又用于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中病原菌負(fù)荷的動態(tài)定量監(jiān)測，密切反映了疾病的進展情況[5]。Yongfeng Hu等人采集1例甲型流感(H7N9)病毒感染后患者不同時間點支氣管肺泡灌洗液行二代測序檢測，通過病毒載量變化評估抗病毒治療效果，此外，監(jiān)測到病毒序列數(shù)明顯減少時，出現(xiàn)鮑曼不動桿菌序列，且隨著病毒序列減少而增多，揭示病毒入侵后繼發(fā)細菌感染，指導(dǎo)臨床給予針對性治療。

在本研究中，我們有效利用NGS的可定量分析特點，用于對血流感染中病原體負(fù)荷的動態(tài)定量監(jiān)測，并指導(dǎo)臨床治療。本例患者膿液及血液培養(yǎng)均為產(chǎn)酸克雷伯菌，NGS結(jié)果與培養(yǎng)在種水平不同，可能與現(xiàn)有的微生物分子分型及表型鑒定方法不一致有關(guān)[6]。在治療過程中我們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)陽性率容易受抗菌藥物使用的影響，常規(guī)實驗室感染指標(biāo)難以精準(zhǔn)評估疾病進展及指導(dǎo)臨床治療。NGS不依賴病原體分離培養(yǎng)，能夠準(zhǔn)確、高效地獲得病原體的基因信息，可以得到樣本中豐度較低甚至是微量病原體信息。因此，盡管抗感染治療后血培養(yǎng)均為陰性， NGS以其靈敏度高及定量優(yōu)勢，極大的幫助了臨床醫(yī)師判斷患者病情進展，指導(dǎo)抗菌治療，避免過度治療的發(fā)生。NGS檢測過程中，直接提取樣本中的全部核酸片段進行檢測，獲得病原體的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)，因此死菌釋放的DNA也可被檢出，不能確定檢測的細菌是否已經(jīng)死亡。但游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)的半衰期短至數(shù)分鐘，使病原體序列數(shù)與病情變化高度相關(guān)，即使檢出的是已死亡的病原體，對指導(dǎo)臨床進行針對性的治療也有重要意義，可以提高細菌培養(yǎng)陰性樣本中的病原體檢出率。希望隨著二代測序技術(shù)的逐步普及，有更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持二代測序技術(shù)的定量分析優(yōu)勢，從而推動其臨床應(yīng)用。